Ферментативная активность почв. Что означает выражение «активность фермента»

Ферментативная активность почв [от лат. Fermentum - закваска] -способность почвы проявлять каталитическое воздействие на процессы превращения экзогенных и собственных органических и минеральных соединений благодаря имеющимся в ней ферментам. Характеризуя ферментативную активность почв, имеют в виду суммарный показатель активности. Ферментативная активность различных почв неодинакова и связана с их генетическими особенностями и комплексом взаимодействующих экологических факторов. Уровень ферментативной активности почв определяется активностью различных ферментов (инвертазы, протеаз, уреазы, дегидрогеназ, каталазы, фосфатаз), выражаемой количеством разложенного субстрата за единицу времени на 1 г почвы.

Биокаталитическая активность почв зависит от степени обогащенности их микроорганизмами и от типа почв. Активность ферментов изменяется по генетическим горизонтам, которые отличаются по содержанию гумуса, типам реакций, окислительно-восстановительным потенциалом и другими показателями по профилю.

В целинных лесных почвах интенсивность ферментативных реакций в основном определяют горизонты лесной подстилки, а в пахотных - пахотные слои. Все биологически менее активные генетические горизонты, находящиеся под горизонтами А или Ап, имеют низкую активность ферментов. Активность их незначительно возрастает при окультуривании почв. После освоения лесных почв под пашню ферментативная активность образованного пахотного горизонта по сравнению с лесной подстилкой резко снижается, но по мере его окультуривания повышается и в сильно окультуренных почвах приближается или превышает показатели лесной подстилки.

Ферментативная активность отражает состояние плодородия почв и внутренние изменения, происходящие при сельскохозяйственном использовании и повышении уровня культуры земледелия. Эти изменения обнаруживаются как при вовлечении целинных и лесных почв в культуру, так и при различных приемах их использования .

По всей Беларуси в пахотных почвах ежегодно теряется до 0,9 т/га гумуса. В результате эрозии ежегодно безвозвратно уносится с полей 0,57 т/га гумуса. Причинами дегумификации почв являются усиление минерализации почвенного органического вещества, отставание процессов новообразования гумуса от минерализации в связи с недостаточным поступлением в почву органических удобрений и снижения ферментативной активности почвы .

Биохимические превращения органического вещества почвы происходят в результате микробиологической деятельности под влиянием ферментов. ферментативный активность почва микроорганизм

Особую роль играют ферменты в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов. Почвенные ферменты участвуют при распаде растительных, животных и микробных остатков, а также синтезе гумуса. В результате питательные вещества из трудно усвояемых соединений переходят в легко доступные формы для растений и микроорганизмов. Ферменты отличаются высокой активностью, строгой специфичностью действия и большой зависимостью от различных условий внешней среды. Благодаря каталитической функции они обеспечивают быстрое протекание в организме или вне его огромного числа химических реакций .

Совместно с другими критериями ферментативная активность почв может служить надёжным диагностическим показателем для выяснения степени окультуренности почв. В результате исследований 4, с. 91 установлена зависимость между активностью микробиологических и ферментативных процессов и проведением мероприятий, повышающих плодородие почв. Обработка почв, внесение удобрений существенно изменяют экологическую обстановку развития микроорганизмов.

В настоящее время в биологических объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, а несколько сотен из них выделено и изучено. Известно, что живая клетка может содержать до 1000 различных ферментов, каждый из которых ускоряет ту или иную химическую реакцию .

Интерес к применению ферментов вызван еще и тем, что постоянно возрастают требования по увеличению безопасности технологических процессов. Присутствуя во всех биологических системах, являясь одновременно продуктами и инструментами этих систем, ферменты синтезируются и функционируют при физиологических условиях (pH, температура, давление, присутствие неорганических ионов), после чего легко выводятся, подвергаясь разрушению до аминокислот. Как продукты, так и отходы большинства процессов, протекающих с участием ферментов, являются нетоксичными и легко разрушаемыми. Кроме того, во многих случаях, ферменты, используемые в промышленности, получают экологически безопасным путем. От небиологических катализаторов ферменты отличают не только безопасность и повышенная способность к биодеградации, но и специфичность действия, мягкие условия протекания реакций и высокая эффективность. Эффективность и специфичность действия ферментов позволяет получать целевые продукты с высоким выходом, что делает использование ферментов в промышленности экономически выгодным. Применение ферментов способствует сокращению расхода воды и энергии в технологических процессах, уменьшает выбросы в атмосферу CO2, снижает риск загрязнения окружающей среды побочными продуктами технологических циклов .

Применением передовой агротехники можно изменять в благоприятную сторону микробиологические процессы не только пахотного, но и подпахотного слоев почвы.

При непосредственном участии внеклеточных ферментов происходит разложение органических соединений почвы. Так, протеолитические ферменты расщепляют белковые вещества и до аминокислот.

Уреаза разлагает мочевину до СО2 и NH3. Образующийся аммиак и аммонийные соли служат источником азотного питания растений и микроорганизмов.

Инвертаза и амилаза участвуют в расщеплении углеводов. Ферменты группы фосфатов разлагают фосфорорганические соединения почвы и играют важную роль в фосфатном режиме последней.

Для характеристики общей ферментативной активности почвы обычно используют наиболее распространенные ферменты, свойственные подавляющему большинству почвенной микрофлоры - инвертазу, каталазу, протеазу и другие .

В условиях нашей республики проводилось немало исследований 16, с. 115 по изучению изменения уровня плодородия и ферментативной активности почв при антропогенном воздействии, однако полученные данные не дают исчерпывающий ответ на характер изменений из-за сложности сопоставления результатов в виду различия условий проведения опытов и методик исследований.

В связи с этим поиск оптимального решения проблемы улучшения гумусного состояния почвы и ее ферментативной активности в конкретных почвенно-климатических условиях на основе разработки ресурсосберегающих приемов основной обработки почвыё применения почвозащитных севооборотов, способствующих сохранению структуры, предотвращению переуплотнения почвы и улучшению их качественного состояния и восстановлению плодородия почв при минимальных затратах, весьма актуален.

Рассмотрим кратко факторы, определяющие скорость реакций, катализируемых ферментами, и вопросы об активировании и ингибировании ферментов.

Как известно, скорость любой химической реакции уменьшается со временем, однако кривая зависимости скорости ферментативных реакций от времени (см.

рис. 4.17) не имеет обычно той общей формы, которая характерна для гомогенных химических реакций. Уменьшение скорости ферментативных реакций во времени может быть обусловлено угнетающим действием продуктов реакции, уменьшением степени насыщения фермента субстратом (поскольку по мере протекания реакции концентрация субстрата снижается), частичной инактивацией фермента при заданных температуре и рН среды. Следует учитывать, кроме того, влияние скорости обратной реакции, которая может оказаться существенной по мере увеличения концентрации продуктов ферментативной реакции. Учитывая эти обстоятельства, при исследовании скорости ферментативных реакций в тканях и биологических жидкостях обычно определяют начальную скорость реакции в условиях, когда скорость ферментативной реакции приближается к линейной (в том числе при достаточно высокой для насыщения фермента концентрации субстрата).

Влияние концентраций субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции

Из приведенного выше материала вытекает важное заключение, что одним из наиболее существенных факторов, определяющих скорость ферментативной реакции, является концентрация субстрата. При постоянной концентрации фермента скорость реакции постепенно увеличивается, достигая определенного максимума (см. рис. 4.12 и 4.13), когда дальнейшее увеличение количества субстрата практически уже не ока­зывает влияния на скорость реакции; в этих случаях принято считать, что субстрат находится в избытке, а фермент полностью насыщен. Ограничивающим скорость реакции фактором в последнем случае становится концентрация фермента.

Скорость любой ферментативной реакции непосредственно зависит от концентра­ции фермента. На рис. 4.18 представлена зависимость между скоростью реакции и повышающимися количествами фермента в присутствии насыщающих концентра­ций субстрата. Существующая линейная зависимость между этими величинами показывает, что скорость реакции пропорциональна количеству присутствующего фермента.

УАктивирование и ингибирование ферментов

Скорость ферментативной реакции, т. е. активность фермента, определяется так­же присутствием в среде активаторов и ингибиторов: первые увеличивают скорость реакции и иногда модифицируют ее, вторые тормозят реакцию. Среди химических соединений, оказывающих влияние на активность ферментов, встречаются разнооб-

Таблица 4.4. Ферменты, активируемые металлами

Фермент	Металл	Фермент	Металл
Цитохромы	Fe	Амилаза	Са
Каталаза	»	Липаза	»
Пероксидаза	>>	Карбоангидраза	Zn
Триптофаноксидаза	»	Лактатдегидрогеназа	»
Гомогентизиказа	»	Уриказа	»
Аскорбатоксидаза	Си	Карбоксипептидаза	»
Тирозиназа	»	Пируваткарбоксилаза	Mg
Фенолоксидаза	»	Фосфатазы	»
Ксантиноксидаза	Мо	Фосфоглюкокиназа	»
Нитратредуктаза	»	Аргиназа	Mn
Альдегидоксидаза	»	Фосфоглюкомутаза	»
Некоторые пептидазы	Со	Холинэстераза	»

разные вещества. Так, соляная кислота активирует действие пепсина, желчные кис­лоты - панкреатической липазы; некоторые тканевые ферменты (оксидоредуктазы, катепсины, аргиназа), растительная протеиназа папаин и другие в значительной сте­пени активируются соединениями, содержащими свободные SH-группы (глутатион, цистеин), а некоторые также витамином С. Особенно часто в качестве активаторов служат (выступают) ионы двухвалентных и иногда одновалентных металлов. Полу­чены доказательства, что около одной четверти всех известных ферментов для про­явления полной каталитической активности нуждаются в присутствии металлов. Мно­гие ферменты вообще не активны в отсутствие металлов. Так, при удалении цинка угольная ангидраза практически лишена ферментативной активности; более того, для действия этого фермента цинк не может быть заменен никаким другим метал­лом. Известны ферменты, действие которых активируется рядом металлов, в част­ности енолаза активируется Mg 2 + , Mn 2 + , К + . В табл. 4.4 приведены примеры участия металлов в действии некоторых ферментов ".

Относительно роли металлов в активирующем действии ферментов имеющиеся данные свидетельствуют о том, что в ряде случаев ионы металлов (Со 2 + , Mg 2 + , Zn 2 + , Fe 2+) выполняют функции простетических групп ферментов или служат акцеп­торами и донорами электронов или выступают в качестве электрофилов или нуклео-филов, сохраняя реактивные группы в необходимой ориентации. В других случаях они способствуют присоединению субстрата к активному центру и образованию фермент-субстратного комплекса. Например, ионы Mg 2+ через отрицательно заряжен­ную фосфатную группу обеспечивают присоединение монофосфорных эфиров органи­ческих веществ к активному центру фосфатаз, катализирующих гидролиз этих соеди­нений. В ряде случаев металл соединяется с субстратом, образуя истинный субстрат, на который действует фермент. В частности, ионы Mg 2+ активируют креатинфос-фокиназу благодаря образованию истинного субстрата - магниевой соли АТФ. На­конец, имеются экспериментальные доказательства прямого участия металлов (напри­мер, ионов Са 2+ в молекуле амилазы слюны) в формировании и стабилизации активного центра и всей трехмерной структуры молекулы фермента. Следует отме­тить также, что металлы нередко выступают в роли аллостерических модуляторов (эффекторов, см. рис. 4.22). Взаимодействуя с аллостерическим центром, подобный металл (эффектор) способствует образованию наиболее выгодной пространственной конфигурации фермента и активного фермент-субстратного комплекса.

Анионы при физиологических концентрациях обычно неэффективны или оказы­вают небольшое активирующее влияние на ферменты. Исключение составляют пеп-

син, некоторые оксидоредуктазы, активируемые анионами, а также амилаза слюны, катализирующая гидролиз крахмала, активность которой повышается при действии ионов хлора, и аденилатциклаза, которая активируется анионами галогенов.

Ингибиторами принято называть вещества, вызывающие частичное или полное торможение реакций, катализируемых ферментами. Недавно открыты анти­ферменты (антиэнзимы), представляющие собой белки (или полипептиды), дей­ствующие как ингибиторы ферментов. К подобным веществам относятся, например, ингибитор трипсина соевых бобов и сывороточный антитрипсин. Они образуют труднодиссоциируемые комплексы с соответствующими ферментами. Иногда инги­битор может входить в состав сложных ферментов, например протеинкиназы и протеинфосфатазы, катализирующих процессы фосфорилирования - дефосфорилиро-вания в живых организмах. Однако до сих пор не выяснено, являются ли подобные антиферменты истинными ингибиторами или регуляторными субъединицами, в част­ности, какова разница в назначении регуляторной (R) субъединицы в составе про­теинкиназы и ингибиторной (I) субъединицы в составе протеинфосфатазы.

Ферменты являются белками, поэтому любые агенты, вызывающие денатурацию белка (нагревание, кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов), приводят к инактива­ции фермента. Однако подобное инактивирование относительно неспецифично. Оно не связано с механизмом действия ферментов. Гораздо большую группу составляют так называемые специфические ингибиторы, которые оказывают свое действие на один какой-либо фермент или группу родственных ферментов. Исследование этих ингибиторов имеет важное значение по ряду причин. Во-первых, ингибиторы могут дать ценную информацию о природе активного центра фермента, а также его функциональных групп и химических связей, обеспечивающих образование фермент-субстратного комплекса. Известны вещества, специфически связывающие ту или иную группу в молекуле фермента, выключая ее из сферы химической реакции. Так, йодацетат 1СН 2 -СООН, его амид и этиловый эфир, парахлормеркурибензоат ClHg-CgH 4 -СООН и другие реагенты сравнительно легко вступают в химическую связь с некоторыми SH-группами ферментов. Если такие группы имеют существен­ное значение для акта катализа, то добавление подобных ингибиторов приводит к полной потере активности фермента:

R- S H+ICH 2 -COOH-«-HI+R- S -CH2-COOH

Действие ряда других ферментов (холинэстераза, трипсин и химотрипсин) сильно тормозится некоторыми фосфорорганическими соединениями, например ДФФ, вследствие блокирования ключевой гидроксильной группы серина в активном центре. Во-вторых, ингибиторы нашли широкое применение в энзимологии при иссле­довании природы множественных форм ферментов и изоферментов, отличающихся не столько по электрофоретической подвижности, сколько по различию чувстви­тельности к одному и тому же ингибитору.

При помощи ингибиторов, выключающих отдельные стадии многоступенчатого метаболического процесса, могут быть точно установлены последовательность хими­ческих реакций и природа участвующих ферментов. Таким образом, при применении йодацетата, фторида и других ингибиторов был расшифрован гликолитический путь окислительно-восстановительных превращений глюкозы до молочной кислоты в мы­шечной ткани, насчитывающий 11 стадий с участием 11 ферментов и 10 промежу­точных метаболитов.

С ингибированием ферментов связан механизм действия многих токсинов и ядов на организм. Так, известно, что при отравлениях синильной кислотой смерть наступает вследствие полного торможения дыхательных ферментов (цитохромокси-дазы), в особенности клеток мозга. Токсическое влияние на организм человека и животных некоторых инсектицидов обусловлено торможением активности холинэсте-разы - фермента, играющего первостепенную роль в деятельности нервной системы.

Рациональная химиотерапия - направленное применение лекарственных препара­тов в медицине - должна основываться на точном знании механизма действия этих препаратов на биосинтез ферментов, сами ферменты или их регуляцию в организме. Иногда для лечения некоторых болезней используют избирательные ингибиторы. Так, ингибитор трипсина, химотрипсина и калликреина - трасилол - широко приме­няется для лечения острого панкреатита. Избирательное ингибиторное действие не­которых природных и синтетических соединений (так называемых антиметаболитов) на ферменты служит основой для разработки эффективных методов синтеза химио-терапевтических препаратов. Этот путь открывает широкие возможности для регу­ляции синтеза ферментов и интенсивности метаболизма.

Типы ингибирования. Различают обратимое и необратимое ингибирование. Если молекула ингибитора вызывает стойкие изменения или модификацию функциональ­ных групп фермента, то такой тип ингибирования называется необратимым. Чаще, однако, имеет место обратимое ингибирование, поддающееся количесгвен-ному изучению на основе уравнения Михаэлиса - Ментен. Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют на конкурентное и неконкурентное, в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата.

Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, име­ющими структуру, похожую на субстрат, но несколько отличающуюся от структуры истинного субстрата. Классическим примером подобного типа ингибирования явля­ется торможение сукцинатдегидрогеназы (СДГ) малоновой кислотой. Этот фермент катализирует окисление путем дегидрирования янтарной кислоты (сукцината) в фу-маровую:

Если в среду добавить малонат (ингибитор), то в результате структурного сход­ства его с истинным субстратом сукцинатом (наличие двух таких же ионизированных карбоксильных групп) он будет реагировать с активным центром с образованием фермент-ингибиторного комплекса, однако при этом переноса водорода от малоната не происходит. Так как структуры субстрата (сукцинат) и ингибитора (малонат)

все же несколько отличаются, они конкурируют за связывание с активным центром,! и степень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната: и сукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора. Этот тип ингибирования" иногда называют ингибированием по типу метаболического антагонизма (рис. 4.19). В общей форме реакция взаимодействия ингибитора с ферментом может быть представлена следующим уравнением:

Образовавшийся комплекс, называемый фермент-ингибиторным комплексом (EI), в отличие от фермент-субстратного комплекса (ES) не распадается с образованием продуктов реакции. Константу диссоциации EI-комплекса, или ингибиторную констан­ту (ATj), можно, следуя теории Михаэлиса - Ментен, определить как отношение констант обратной и прямой реакций:

т. е. ингибиторная константа прямо пропорциональна произведению концентрации фермента и ингибитора и обратно пропорциональна концентрации Е1-комплекса.

Метод конкурентного торможения нашел широкое применение в медицинской практике. Известно, например, что для лечения некоторых инфекционных заболева­ний, вызываемых бактериями, применяют сульфаниламидные препараты. Оказалось, что эти препараты имеют структурное сходство с парааминобензойной кислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являю­щейся составной частью ферментов бактерий. Благодаря этому структурному сходству сульфаниламид блокирует действие фермента путем вытеснения парааминобензойной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту, что ведет к торможению роста бактерий.

Некоторые аналоги витамина В 6 и фолиевой кислоты, в частности дезоксипири-доксин и аминоптерин (см. главу 5), действуют как конкурентные, так называемые коферментные ингибиторы (или антивитамины), тормозящие многие биохимические процессы в организме.

Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющи­ми структурного сходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента. Степень торможения во многих случаях определяется продолжительностью действия ингибитора на фермент. При данном типе ингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной связи фермент часто подвергается полной инактивации, и тогда торможение становится необратимым. Примерами необратимого ингибирования (инактивации) является действие йодацетата, ДФФ, а также диэтил-п-нитрофенилфосфата и синильной кис­лоты, заключающееся в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов в молекуле фермента.

Для выяснения вопроса о типе ингибирования пользуются уравнениями Михаэли-са - Ментен, Лайнуивера - Бэрка или другими, например уравнением Эди - Хофсти:

и соответствующими графиками в прямолинейных координатах.

На рис. 4.20 видно, что при конкурентном типе ингибирования ингибитор уве­личивает значение К т (на величину, равную разнице в длине отрезков, отсекаемых на оси абсцисс), не оказывая влияния на максимальную скорость. Это означает, что при достаточно высокой концентрации субстрата [S] ингибитор вытесняется молеку­лами субстрата из комплекса EI. При неконкурентном ингибировании (рис. 4.21) ингибитор снижает величину максимальной скорости. Если при этом величина К т не уменьшается, то говорят о полностью неконкурентном ингибировании. Подобный тип ингибирования имеет место при образовании неактивных, труднодиссоциирующих комплексов EI и (или) EIS. Часто, однако, имеет место смешанный тип ингибирова­ния (иногда называемый частично неконкурентным типом), при котором снижение F max сочетается с одновременным увеличением К т. Это означает, что комплекс EI сохраняет частичную активность, т. е. способность к образованию промежуточного тройного комплекса EIS, в котором субстрат подвергается замедленному каталити­ческому превращению. В редких случаях степень торможения активности фермента может увеличиваться с повышением концентрации субстрата; для этого типа тормо­жения был предложен довольно неточный термин бесконкурентное ингиби-рование. Один из механизмов такого торможения обусловлен возможностью соеди­нения ингибитора с комплексом ES с образованием неактивного или медленно реагирующего тройного комплекса ESI.

Таким образом, при графическом анализе скоростей ферментативных реакций как функции концентраций субстрата может быть получена ценная информация по кинетике ферментативных реакций, освещающая возможный механизм ферментатив­ного катализа.

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Одним из уникальных свойств живых организмов является удивительная сбалан­сированность катаболических (биодеградативных) и анаболических (биосинтетических) процессов. При этом в клетках одновременно совершаются процессы синтеза, рас­пада и взаимопревращения сотен и тысяч разнообразных веществ, которые регули­руются множеством регуляторных механизмов, обеспечивающих постоянство внутрен­ней среды организма. Некоторые из этих регуляторных механизмов, среди которых важная роль принадлежит механизмам регуляции активности ферментов, будут рас­смотрены ниже.

_£Влияние закона действия масс. В катализируемой ферментом обратимой хими­ческой реакции, например: А + В <=* С + D концентрация компонентов реакции и со­ответственно направление реакции будут регулироваться влиянием закона действия масс. Оно, в частности, может быть показано в обратимой реакции трансаминиро-вания, катализируемой ферментом аланинаминотрансферазой:

Алании + а-Кетоглутарат +± Пируват + Глутамат

Этот тин регуляции играет, очевидно, лишь ограниченную роль, поскольку в ре­альных условиях реакция обычно протекает в одном направлении, так как образо­вавшиеся продукты могут оказаться субстратами для действия других ферментов и выводиться из сферы реакции; в этих случаях устанавливается скорее устойчивое (стационарное) состояние, чем истинное равновесие.

^Изменение количества фермента. На бактериях хорошо изучен феномен индуци­рованного синтеза ферментов при выращивании их на среде, где единственным источником углерода и энергии служит тот или иной углевод, например глюкоза. Замена глюкозы в среде на лактозу приводит к индуцированному или адаптивному (после небольшого периода лагфазы) синтезу фермента галактозидазы (программи­рованному лактозным геном, см. главу 13), расщепляющей лактозу на глюкозу и галактозу. В животных тканях подобный быстрый синтез ферментов наблюдается сравнительно реже, и механизм, индуцирующий синтез, изучен только для неболь­шого числа ферментов (тирозинтрансаминазы, серии- и треониндегидратазы, трипто-фанпирролазы и др.). Однако при поступлении в организм некоторых ядов, канцеро­генных веществ, алкалоидов, инсектицидов наблюдается резкое увеличение через несколько дней активности (соответственно количества) ферментов - гидроксилаз эндоплазматической сети клеток печени, окисляющих чужеродные вещества в неток­сичные для организма продукты. С другой стороны, описаны случаи, когда под действием подобных гидроксилаз чужеродные вещества превращаются в организме в более токсичные соединения. Это явление, обратное детоксикации, получило название летального синтеза.

"-■ Проферменты. Протеолитические ферменты желудочно-кишечного тракта и под­желудочной железы синтезируются в неактивной форме, в виде проферментов (зимогенов). Регуляция в этих случаях сводится к правращению проферментов в ак­тивные ферменты под влиянием специфических агентов. Так, трипсин синтезируется в поджелудочной железе в форме трипсиногена. Последний превращается в актив­ный трипсин в кишечнике в результате аутокатализа или под действием других про-теиназ (см. главу 11). Превращение неактивного пепсиногена в активный пепсин осуществляется аутокаталитически в результате ограниченного протеолиза в присут­ствии соляной кислоты и также связано с отщеплением от профермента специфи­ческого ингибитора полипептидной природы. Синтез протеиназ в неактивной форме и ряда других неактивных белков-предшественников имеет, очевидно, определенный биологический смысл, предотвращая разрушение клеток органов, в которых образу­ются проферменты.

Химическая модификация фермента. Некоторые белки при формировании третич­ной структуры подвергаются постсинтетической модификации (см. главу 1). Оказалось,

что ключевые ферменты энергетического обмена - фосфорилаза, гликогенсинтаза и др. - также контролируются путем фосфорилирования и дефосфорилирования, осуществляемого специфическими ферментами - протеинкиназой и протеинфосфата-зой, уровень активности которых в свою очередь регулируется гормонами. Уровень активности ключевых ферментов обмена углеводов и соответственно интенсивность и направленность самих процессов обмена определяются соотношением фосфорили-рованных и дефосфорилированных форм этих ферментов. Химическая постсинтети­ческая модификация ферментов включает, кроме того, процессы ограниченного про-теолиза, метилирования, гликозилирования и другие, обеспечивая тем самым микро­скопический тип регуляции активности ферментов и соответственно физиологическую скорость процессов обмена веществ.

Регуляция активности ферментов по принципу обратной связи. Во многих строго биосинтетических реакциях основным типом регуляции скорости многоступенчатого ферментативного процесса является ингибирование по принципу обратной связи, когда конечный продукт биосинтетической цепи подавляет активность фермента, катализи­рующего первую стадию.

Предположим, что в клетках осуществляется многоступенчатый биосинтетический процесс, каждая стадия которого катализируется собственным ферментом:

Скорость подобной суммарной последовательности реакций в значительной степени определяется концентрацией конечного продукта (Р), накопление которого выше допустимого уровня оказывает мощное ингибирующее действие на первую стадию процесса, соответственно на фермент E t .

Впервые существование подобного механизма контроля активности ферментов метаболитами было показано у Е. coli при исследовании синтеза изолейцина и ЦТФ. Оказалось, что изолейцин, являющийся конечным продуктом, избирательно подав­ляет активность треониндегидратазы, катализирующей первое звено процесса превра­щения треонина в изолейцин, насчитывающего пять ферментативных реакций. Ана­логично ЦТФ как конечный продукт биосинтетического пути оказывает ингибирую-щий эффект на первый фермент (аспартаткарбамоилтрансферазу), регулируя тем самым свой собственный синтез. Этот тип ингибирования получил название ингибирования по принципу обратной связи или ретроингибирования. Существование его доказано во всех живых организмах, и в настоящее время он рассматривается как один из ведущих типов регуляции активности ферментов и клеточного метаболизма в целом".

С другой стороны, в амфиболических процессах, выполняющих одновременно биосинтетические и биодеградативные функции 2 , доказано существование регуляции как по типу ретроингибирования, так и макроэргическими соединениями - индика­торами энергетического состояния клетки. Для амфиболических процессов уникаль­ным типом регуляции, свойственным только им, является, кроме того, актива­ция предшественником, когда первый метаболит в многоступенчатом пути активирует фермент, катализирующий последнюю стадию. Так, доказано активирую­щее влияние глюкозо-6-фосфата, являющегося предшественником гликогена, на фер­мент гликогенсинтазу.

Подобные типы ингибирования конечным продуктом и активирования первым продуктом свойственны аллостерическим (регуляторным) ферментам, когда эффектор, структурно отличаясь от субстрата, связывается в особом (аллостерическом) центре молекулы фермента, пространственно удаленном от активного центра. Взаимопревра­щения активного и неактивного аллостерического фермента в упрощенной форме, а также конформационные изменения, наблюдаемые при присоединении субстрата и эффекторов, представлены на рис. 4.22. Присоединение отрицательного эффектора к аллостерическому центру вызывает значительные изменения конфигурации актив­ного центра молекулы фермента, в результате чего фермент теряет сродство к своему субстрату (образование неактивного комплекса).

Аллостерические взаимодействия проявляются в характере кривых зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата или эффектора, в част­ности в S-образности этих кривых (отклонение от гиперболической кривой Михаэли-са - Ментен). Это означает, что связывание одной молекулы субстрата облегчает связывание второй молекулы в активном центре, способствуя тем самым увеличению скорости реакции. Кроме того, для аллостерических регуляторных фер­ментов характерна нелинейная зависимость скорости реакции от концентрации фер­мента.

Другие типы регуляции активности ферментов. Существует ряд других механиз­мов, контролирующих скорость метаболических процессов и активность внутри­клеточных ферментов. Абсолютное количество присутствующего в клетке фермента регулируется скоростью его синтеза и распада. К регуляторным механизмам могут быть отнесены также конкуренция ферментов за общий субстрат, выключение актив­ности одного из изоферментов (у множественных форм ферментов), влияние кон­центраций кофакторов и явление компартментализации. Механизм ком-партментализации играет, по-видимому, важную биологическую роль, пространствен­но разъединяя с помощью биомембран ферменты со своими субстратами (например, лизосомальные ферменты: протеиназы, фосфатазы, рибонуклеазы и другие гидро­литические ферменты, с цитоплазматическими веществами, на которые они действуют). Кроме того, этот механизм позволяет разделить несовместимые в одно и то же время метаболические процессы. Примером последних могут быть пути синтеза жирных кислот, протекающие в основном в растворимой фракции цитоплазмы, и пути распада жирных кислот, сосредоточенные в митохондриях.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности, поскольку, за редким исключением, ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции в определенных, согласован­ных условиях измерения. Лри оптимальных условиях температуры, рН среды и полном насыщении фермента субстратом скорость катализируемой реакции пропорциональна

концентрации фермента. О ско­рости ферментативной -реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости об­разования продукта реакции. Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его активности Комиссия по ферментам Международного биохимического союза реко­мендовала стандартную между­народную единицу (Е или U): ! за единицу активности любого фермента принима­ется то количество его, которое в оптимальных условиях ката­лизирует превращение 1 микро­моля субстрата в минуту (мкмоль/мин). В связи с введе­нием Международной системы единиц (СИ) предложено новое определение ферментной едини­цы катал (кат, kat); 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реак­цию со скоростью, равной 1 молю в 1 с (1 моль/с). От­ношение международной еди­ницы (Е) к каталу можно вы­разить следующим образом: 1 кат=1 моль -с" " = 60 моль х х мин " = 60 10 6 мкмоль х х мин" 1 = 6 10 7 Е; или 1 Е = = 1 мкмоль мин ~" =

= (1/60) мкмоль с " = = (1/60) мккат = 16,67 нкат. Та­ким образом, 1 Е фермента соответствует 16,67 нкат._23

Рекомендовано, кроме того, проведение измерения единиц фермента при 25 °С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субртрата и будет зависеть только от концентрации фермента.

Для выражения активности в практической работе с ферментами часто пользу­ются производными понятиями удельной и молярной активности. Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Число молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в се­кунду, принято называть числом оборотов, или молярной активностью (молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г-моль фермента). Одна молекула каталазы эритроцитов способна, например, расщепить в 1 с 44 000 мо­лекул перекиси водорода 1 .

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

Вопрос о локализации ферментов в структурных образованиях клетки (ядро, митохондрии, лизосомы и др.) является чрезвычайно важным, особенно в препара­тивной энзимологии, когда перед исследователем поставлена задача изолировать и выделить фермент в чистом виде. Сравнительно легко обнаружить локализацию фермента методами цито- и гистохимии. Для этого тонкие срезы органа инкуби­руют с соответствующими субстратами, и после инкубации локализацию продукта реакции открывают добавлением подходящих реактивов по развитию специфической окраски.

В препаративной энзимологии чаще пользуются методом дифференциального центрифугирования гомогенатов тканей. Для этого сначала разрушают клеточную структуру с помощью подходящего дезинтегратора и полученную квазиоднородную (гомогенизированную) массу подвергают дифференциальному центрифугированию при температуре 0 - 4 °С. Примерная схема дифференциального центрифугирования гомо­генатов в высокоскоростных центрифугах представлена на рис. 4.23 ". Обычно распре­деление ферментов изучают в последовательных индивидуальных фракциях, изоли­рованных при дробном центрифугировании гомогенатов, в частности во фракции ядер, которую получают при низкой скорости центрифугирования, во фракции митохондрий, которая осаждается при средней скорости центрифугирования, во фрак­ции микросом (или рибосом), для изолирования которой требуется высокая скорость центрифугирования, и, наконец, в оставшейся прозрачной надосадочной жидкости (супернатант), представляющей собой растворимую фракцию цитоплазмы. Следует отметить, что фракция митохондрий не является гомогенной, поскольку из нее уда­ется изолировать частицы, известные как лизосомы, размер которых занимает про­межуточное место между размерами митохондрий и микросом. В свою очередь микросомальная фракция также является гетерогенной, поскольку она происходит в основном из элементов эндоплазматической сети неоднородного строения.

При помощи метода фракционирования в центрифугах было показано, что ядер­ная фракция печени и почек содержит незначительное число ферментов, хотя известно, что в ядрах осуществляется синтез некоторых белков. Основным местом синтеза белка, как теперь установлено, является фракция рибосом цитоплазмы. Показано, кроме того, что ферменты гликолиза сосредоточены преимущественно в растворимой фракции цитоплазмы, в то время как цитохромоксидаза и ферменты цикла Кребса локализованы во фракции митохондрий. С митохондриями связаны также ферменты, катализирующие окислительное фосфорилирование и распад жирных кислот. Фермен­ты, катализирующие биосинтез жирных кислот, наоборот, содержатся в растворимой фракции цитоплазмы.

Для изолирования и выделения ферментов из биологических объектов в чистом (гомогенном) состоянии используется весь арсенал методов выделения белков в ин­дивидуальном виде, который был подробно рассмотрен выше (см. главу 1).

КЛАССИФИКАЦИЯ И НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТОВ

Современная классификация и номенклатура ферментов была разработана Ко­миссией по ферментам Международного биохимического союза и утверждена на V Международном биохимическом конгрессе в 1961 г. в Москве 2 .

Необходимость систематики номенклатуры диктовалась прежде всего стреми­тельным ростом числа вновь открываемых с каждым годом ферментов, которым разные исследователи присваивали названия по своему усмотрению. Более того, для одного и того же фермента подчас употребляли два или несколько названий, что вносилу путаницу в номенклатуру. Некоторые названия ферментов вообще не от­ражали тип катализируемой реакции.

До 1961 г. не было единой классификации ферментов. Трудности заключались в том, что разные исследователи за основу классификации ферментов брали различ­ные принципы. Комиссией были рассмотрены три принципа, которые могли служить основой для классификации ферментов и их обозначения. Первый принцип - хими­ческая природа фермента, т. е. принадлежность к флавопротеинам, пиридоксальфосфат-протеинам, гемопротеинам, металлопротеинам и т. д. Однако этот принцип не мог служить общей основой для классификации, так как только для небольшого числа ферментов известны простетические группы, доступные идентификации и прямому определению. Второй принцип - химическая природа субстрата, на который действу­ет фермент; по этому принципу трудно классифицировать фермент, так как в качестве субстрата могут служить разнообразные соединения внутри определенного класса веществ (белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты) и бесчисленное множество промежуточных продуктов обмена. В основу принятой классификации положен тре­тий принцип - тип катализируемой реакции, который является специфич­ным для действия любого фермента; этот принцип логично использовать в качестве основы для классификации и номенклатуры ферментов.

Таким образом, тип катализируемой химической реакции в сочетании с назва­нием субстрата (субстратов) и служит основой для систематического наименования ферментов. Согласно этой классификации ферменты делят на шесть главных клас­сов: 1) оксидоредуктазы; 2) трансферазы; 3) гидролазы; 4) лиазы; 5) изомеразы; 6) лигазы (синтетазы).

Оксидоредуктазы. К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе биологического окисле­ния. Систематические названия их составляют по форме «донор: акцептор оксидо-редуктаза», например лактат: НАД" 1 " оксидоредуктаза для ЛДГ.

Различают следующие основные оксидоредуктазы: аэробные дегидрогеназы или оксидазы, катализирующие перенос протонов (электронов) непосредственно на кисло­род, анаэробные дегидрогеназы, ускоряющие перенос протонов (электронов) на про­межуточный субстрат, но не на кислород, цитохромы, катализирующие перенос только электронов. К этому классу относятся также гемсодержащие ферменты ка-талаза и пероксидаза, катализирующие реакции с участием перекиси водорода.

Трансферазы. К классу трансфераз относят ферменты, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных атомов, групп атомов и радикалов. Наиме­нование их составляется по форме: «донор: транспортируемая группа - трансфераза».

Различают трансферазы, катализирующие перенос одноуглеродных остатков, ацильных, гликозильных, альдегидных или кетонных, нуклеотидных остатков, азо­тистых групп, остатков фосфорной и серной кислот и др. Например: метил- и фор-милтрансферазы, ацетилтрансферазы, аминотрансферазы, фосфотрансферазы и др.

Гидролазы. В класс гидролаз входит большая группа ферментов, катализирующих расщепление внутримолекулярных связей органических веществ при участии молеку­лы воды. Наименование их составляется по форме: «субстрат - гидролаза». К ним относятся: эстеразы - ферменты, катализирующие реакции гидролиза и синтеза слож­ных эфиров гликозидазы, ускоряющие разрыв гликозидных связей, фосфатазы и пеп-тидгидролазы, катализирующие гидролиз фосфоангидридных и пептидных связей амидазы, ускоряющие разрыв кислотно-ангидридных связей, отличных от пептид­ных, и др.

Лиазы. К классу лиаз относят ферменты, катализирующие разрыв С-О, С-С, С-N и других связей, а также обратимые реакции отщепления различных групп

от субстратов не гидролитическим путем; эти реакции сопровождаются образование»!

двойной связи или присоединением групп к месту двойной связи. Ферменты обозна*!

чаются термином: «субстрат -лиазы». Например, фумарат-гидратаза (систематичен

ское название: L-малат-гидролиаза) катализирует обратимое отщепление молекулй;

воды от яблочной кислоты с образованием фумаровой кислоты. В эту же группу"

входят декарбоксилазы (карбокси-лиазы), амидин-лиазы и др.

Изомеразы. К классу изомераз относят ферменты, катализирующие различные

типы реакций изомеризации. Систематическое название их составляется с учетом

типа реакции: «субстрат - цис-транс-изомераза». Если изомеризация включает внутри­молекулярный перенос группы, фермент получает название мутазы.

К классу изомераз относят рацемазы и эпимеразы, действующие на амино- и оксикислоты, углеводы и их производные, внутримолекулярные оксидоредуктазы, ка­тализирующие взаимопревращения альдоз и кетоз, внутримолекулярные трансфера-зы, переносящие ацильные, фосфорильные и другие группы, и т. д.

Лш азы (синтетазы). К классу лигаз относят ферменты, катализирующие синтез органических веществ из двух исходных молекул с использованием энергии распада АТФ (или другого нуклеозидтрифосфата). Систематическое название их составляют по форме: «X: Y лигаза», где через X и Y обозначаются исходные вещества. В ка­честве примера можно назвать L-глутамат: аммиак лигазу (глутаминсинтетазу), при участии которой из глутаминовой кислоты и аммиака в присутствии АТФ синтези­руется глутамин.

СПИСОК ФЕРМЕНТОВ

На основании разработанной системы, которая служит основой как для класси­фикации, так и для нумерации (индексации) ферментов, Международная комиссия подготовила также Классификацию ферментов (КФ) с включением списка ферментов, первоначально состоявшего к 1961 г. примерно из 900 ферментов. В списке фермен­тов (см. Номенклатуру ферментов, 1979) насчитывалось уже 2142 индивидуальных фермента; к настоящему времени их идентифицировано еще больше. В списке для каждого фермента, помимо номера (шифра), приводятся систематическое (рациональ­ное) название, рекомендуемое (рабочее) название, химическая реакция, которую ката-, лизирует данный фермент, а также примечания о специфичности действия. Присвое­ние номера для каждого фермента рекомендуется проводить по четырехзначному шифру.

Таким образом, шифр каждого фермента содержит четыре цифры, раз­деленные точками, и составляется по следующему принципу. Первая цифра указы­вает номер одного из шести главных классов ферментов. Вторая цифра означает подкласс, характеризующий основные виды субстратов, участвующих в данном типе химических превращений. Например, у трансфераз вторая цифра указывает на при­роду той группы, которая подвергается переносу, у гидролаз - на тип гидролизуемой связи и т. д. Эти подклассы в свою очередь делятся на более частные подгруппы (обозначаемые подподклассами), отличающиеся химической природой соединений (доноров или акцепторов), участвующих в данной подгруппе реакций. Номер, точнее цифра, подподкласса ставится на третьем месте в шифре фермента. У гидролаз, например, эта цифра уточняет тип гидролизуемой связи, а у лиаз - тип отщепляемой группы и т. д. Первые три цифры кода точно определяют тип фермента. Наконец, все ферменты, относящиеся к данному подподклассу, получают порядковый номер в алфавитном порядке, который ставится на четвертом месте в шифре.

Таким образом, каждый фермент, характеризующийся постоянной совокупностью четырех цифр, имеет соответствующий шифр, под которым он внесен в список фер­ментов. В качестве примера в табл. 4.5 приводятся два фермента из списка.

Таблица 4.5. Фрагмент	из списка ферментов
	Рекомендуемое		Систематическое	Примечания о специфич-
Шифр	(рабочее)	Реакция	название	ности и другие
	название			зависимости
КФ 1.1.1.27	Лактатдегид-	L-лактат + НАД+ =	L-лактат:	Окисляет и другие
	рогеназа	пируват + НАДН 2	НАД + -оксидоре-	оксимонокарбоновые
			дуктаза	кислоты
КФ 2.6.1.5	Тирозинами-	L-тирозин + 2-оксо-	L-тирозин:	Протеин пиридок-
	нотрансферача	глутарат = 4-оксифе-	2-оксоглутарат	сальфосфата. Фени-
		нилпируват + L-глу-	аминотрансфера-	лаланин может дей-
		тамат	за	ствовать вместо ти-
				розина

Следует особо отметить, что Международную классификацию ферментов нельзя считать абсолютно совершенной, поскольку она в некоторых отношениях не соот­ветствует общепринятой в органической химии классификации химических реакций, несмотря на то, что ферменты катализируют по существу те же реакции.

Понятие активности фермента

В повседневной биохимической практике практически не оценивается количество фермента, а только его активность. Активность - более широкое понятие, чем количество. Она подразумевает в первую очередь результат реакции , а именно убыль субстрата или накопление продукта. Естественно, при этом нельзя игнорировать время, которое проработал фермент и число молекул фермента. Но так как число молекул фермента подсчитать обычно нереально, то используют количество биологического материала, содержащего фермент (объем или массу).

Таким образом при определении активности ферментов нужно одновременно учитывать три переменные:

• масса полученного продукта или исчезнувшего субстрата;
• время, потраченное на реакцию;
• количество фермента, но на самом деле массу или объем биологического материала, содержащего фермент.

Для понимания соотношений указанных факторов наглядным и простым примером может служить строительство двух зданий. Здания приравняем к продукту реакции, рабочие - это ферменты, бригада пусть соответствует объему биологического материала. Итак, задачи из 3-го класса:

1. На постройке одного здания трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания - бригада из 5 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?
2. На постройке одного здания из 3 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого здания из 12 этажей - бригада тоже из 10 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?
3. На постройке одного здания из 5 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания - бригада тоже из 10 человек. Строительство первого здания заняло 20 дней, второе построено за 10 дней. Где выше активность рабочих?

Основы количественного определения активности ферментов

1. Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала, содержащего фермент.

В практике обычно используют:

• единицы количества вещества - моль (и его производные ммоль, мкмоль), грамм (кг, мг),
• единицы времени - минута, час, секунда,
• единицы массы или объема - грамм (кг, мг), литр (мл).

Активно используются и другие производные - катал (моль/с), международная единица активности (МЕ, Unit) соответствует мкмоль/мин.

Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с×л, г/час×л, МЕ/л, кат/мл и т. д.

Например, известно,

2. Создание стандартных условий, чтобы можно было сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях - оптимальная рН и фиксированная температура, например, 25°С или 37°С, соблюдение времени инкубации субстрата с ферментом.

Ферментативная активность микроорганизмов богата и разнообразна. По ней можно установить не только видовую и типовую принадлежность микроба, но и опреде­лить его варианты (так называемые биовары). Рассмот­рим основные ферментативные свойства и их качественное определение.

Расщепление углеводов (сахаролитическая активность), т. е. способность расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа, изучают на средах Гисса, которые содержат тот или иной углевод и индикатор. Под действием образующейся при расщеплении углевода кислоты индикатор изменяет окра­ску среды. Поэтому эти среды названы «пестрый ряд». Микробы, не ферментирующие данный углевод, растут на среде, не изменяя ее. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков в средах с агаром или по скопле­нию его в «поплавке» на жидких средах. «Поплавок» - узкая стеклянная трубочка с запаянным концом, обращен­ным вверх, которую до стерилизации помещают в пробир­ку со средой.

Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах Эндо, ЭМС, Плоскирева. Микроорганизмы, сбра­живая до кислоты находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу), образуют окрашенные колонии - кислота изменяет цвет имеющегося в среде индикатора. Колонии микробов, не ферментирующих лактозу, бесцветны.

Молоко при росте микробов, сбраживающих лактозу, свертывается.

При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщеп­ление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя - цвет среды не изменяется. Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

Протеолитические свойства (т. е. способность расщеп­лять белки, полипептиды и т. п.) изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном. При росте на желатиновой среде микробов, ферментирующих жела­тин, среда разжижается. Характер разжижения, вызываемый разными микробами, различен. Микробы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока -оно приобретает вид молочной сыво­ротки. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образование устанавлива­ют с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают, нарезают узенькими полосками длиной 5 - 6 см. и после посева культуры на МПБ помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводо­рода на бумажке, пропитанной 20% раствором свинца ацетата и натрия гидрокарбоната, происходит образование свинца сульфата - бумажка чернеет; индол вызывает пок­раснение бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты.

Помимо указанных сред, способность микроорганиз­мов расщеплять различные питательные субстраты опре­деляют с помощью бумажных дисков, пропитанных опре­деленными реактивами (системы индикаторные бумажные «СИБ»). Эти диски опускают в пробирки с исследуемой культурой и уже через 3 ч инкубации в термостате при 37 °С по изменению цвета дисков судят о разложении углеводов, аминокислот, белков и т. д.

Гемолитические свойства (способность разрушать эрит­роциты) изучают на средах с кровью. Жидкие среды при этом становятся прозрачными, а на плотных средах вокруг колонии появляется прозрачная зона. При образовании метгемоглобина среда зеленеет.

СОХРАНЕНИЕ КУЛЬТУР

Выделенные и изученные культуры (штаммы), пред­ставляющие ценность для науки или производства, хранят в музеях живых культур. Общесоюзный музей находится в Государственном НИИ стандартизации и контроля меди­цинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича (ГИСК).

Задача хранения - поддержать жизнеспособность микроорганизмов и предупредить их изменчивость. Для этого надо ослабить или прекратить обмен в микробной клетке.

Один из самых совершенных методов длительного сохранения культур - лиофилизация - высушивание в вакууме из замороженного состояния позволяет создать состояние анабиоза. Высушивание проводят в специальных аппаратах. Хранят культуры в запаянных ампулах при температуре 4 °С, лучше при -30-70 °С.

Восстановление высушенных культур.

Сильно нагрева­ют кончик ампулы в пламени горелки и прикасаются к нему ватным тампоном, слегка смоченным холодной водой, чтобы на стекле образовались микротрещины, через которые воздух медленно просочится внутрь ампу­лы. При этом, проходя через разогретые края трещин, воздух стерилизуется.

Не забывайте, что в запаянной ампуле вакуум. Если воздух в нее попадает сразу через большое отверстие, может распылить­ся находящаяся в ампуле культура и произойти ее выброс.

Дав войти воздуху, быстро пинцетом надламывают и удаляют верхушку ампулы. Слегка обжигают отверстие и стерильной пастеровской пипеткой или шприцем вносят в ампулу растворитель (бульон или изотонический раствор). Перемешивают содержимое ампулы и засевают на среды. Рост восстановленных культур в первых посевах может быть замедлен.

Длительно сохранять культуры Можно также в жидком азоте (-196 °С) в специальных приборах.

Методы непродолжительного сохранения культур следу­ющие: 1) субкультивирование (периодические пересевы на свежие среды) с интервалами, зависящими от свойств микроорганизма, среды и условий культивирования. Меж­ду пересевами культуры хранят при 4 °С; 2) сохранение под слоем масла. Культуру выращивают в агаре столби­ком высотой 5-6 см, заливают стерильным вазелиновым маслом (слой масла примерно 2 см) и хранят вертикально в холодильнике. Сроки хранения у разных микроорганиз­мов разные, поэтому из пробирок периодически высевают культуру, чтобы проверить ее жизнеспособность; 3) хра­нение при -20-70 °С; 4) хранение в запаянных пробир­ках. По мере надобности сохраняемый материал высевают на свежую среду.

Глава 8. ФАГИ

Фаги - вирусы бактерий и ряда других микроорганиз­мов. В определенных условиях они вызывают лизис (растворение) своих хозяев. Действие фагов проявляется в природе и используется в практике.

Рис.42 Бактериофаги

История открытия и изучения фага. В 1898 г. Н. Ф. Га­малея показал, что фильтрат сибиреязвенных бацилл вызывает лизис свежих культур этих микроорганизмов, В 1915 г. Ф. Ту орт обнаружил, что белые непрозрачные колонии стафилококков становились прозрачными и исче­зали и что агент, лизирующий стафилококки, проходит через бактериальные фильтры, сохраняя способность ра­створять свежие культуры микроорганизмов. Явление лизиса микроорганизмов было описано, но природа его не изучена. Вот почему честь открытия бактериофага принадлежит канадскому ученому д"Эреллю.

Д"Эрелль (1917) изучал фильтраты испражнений, кото­рые брал ежедневно у больного дизентерией и вносил в пробирки со свежезасеянной культурой возбудителя этой болезни. После инкубации в термостате культура выраста­ла. Но однажды она не выросла, а растворилась. Это совпало с началом выздоровления больного.

Д"Эрелль показал, что лизирующая способность фильтратов испражнений усиливалась при последовательных пассажах на свежих культурах бактерий. Из этого ученый сделал вывод, что растворяет их живой агент, проходящий через бактериальные фильтры, т. е. вирус. В настоящее время его точка зрения принята большинством ученых.

Открытый вирус д"Эрелль назвал бактериофагом- пожирателем бактерий (от греч. фагос -пожирающий), а явление - бактериофагией.

С открытием электронного микроскопа была подтвер­ждена корпускулярная природа фага и изучена его морфо­логия.

Открытие д"Эрелля привлекло внимание врачей, применивших фаг для лечения и профилактики ряда инфекцион­ных болезней. В настоящее время фаги широко использу­ют в медицинской практике и при различных биологиче­ских исследованиях. Фагами занимаются бактериологи, вирусологи, биохимики, генетики, биофизики, молекулярные биологи, экспериментальные онкологи, специалисты по генной инженерии и биотехнологии и т. д. Изучение фага продолжается, как одна из интереснейших глав биологии.

СВОЙСТВА ФАГОВ

Морфология фагов. Большинство фагов состоит из головки и хвостового отростка, поэтому их сравнивают с головастиками или сперматозоидами. Наиболее изучены Т-фаги кишечной палочки). Их отросток представ­ляет собой полый цилиндр (стержень), покрытый чехлом и заканчивающийся базальной пластинкой с шипами и фиб­риллами. Размеры фагов, форма и величина головки, длина и строение отростка различны у разных фагов. Например, встречаются фаги с длинным отростком, чехол которого не сокращается, фаги с коротким отростком, без отростка и нитевидные

Химический состав фагов. Как и все вирусы, фаги состоят из нуклеиновой кислоты одного типа (чаще встречаются ДНК-фаги) и белка. Молекула нуклеиновой кислоты, скрученная в спираль, находится в головке фага. Оболочка фага (капсид) и отросток имеют белковую природу. На свободном конце отростка содержится литический фермент, обычно лизоцим или гиалуронидаза.

Взаимодействие фага с чувствительной клеткой прохо­дит через последовательные стадии. Весь цикл занимает в разных системах фаг -бактерия от нескольких минут до 1-2 ч. Разберем последовательность этого процесса на примере Т-четного фага кишечной палочки.

Стадия I - адсорбция частиц фага на поверхно­стных рецепторах клетки осуществляется с помощью нитей хвостового отростка. На одной клетке могут адсор­бироваться сотни фагов (для лизиса клетки достаточно одного). Адсорбция фагов специфична.

Стадия II - проникновение (инъекция) нуклеино­вой кислоты фага в клетки у разных фагов происходит по-разному. У Т-фагов кишечной палочки шипы базальной пластинки соприкасаются с клеточной стенкой. Стержень «прокалывает» клеточную стенку. Фермент, находящийся в отростке, чаще всего лизоцим, разрушает цитоплазматическую мембрану. При этом чехол отростка сокращается, и через канал стержня нуклеиновая кислота фага «впры­скивается» в клетку. Пустая белковая оболочка фага («тень») остается снаружи.

Стадия III - репродукция белка и нуклеиновой кислоты фага внутри клетки.

Стадия IV - сборка и формирование зрелых частиц фага.

Рис.43 Строение фага.

1 - головка; 2 - ДНК; 3 - стержень; 4 - чехол; 5 - базальная пластинка; 6-шипы; 7 - хвостовые фибриллы.

Рис.44 Морфология фагов.

1- фаги с головкой, отро­стком и сокращающимся чех­лом; 2--головка и отросток, без сократительной способно­сти; 3 - головка и короткий отросток; 4 -бесхвостые фа­ги; 5--нитевидные фаги.

Стадия V-лизис клетки и выход зрелых частиц фага из нее. Обычно происходит разрыв клеточной стенки и в окружающую среду выходит несколько сот новых фагов, способных поражать свежие клетки. Такой лизис называется лизисом изнутри.

В отличие от лизиса изнутри лизис извне происходит тогда, когда на клетке адсорбируется сразу очень боль­шое количество фагов. Они проделывают в клеточной стенке многочисленные отверстия, через которые вытека­ет содержимое клетки. Таким образом, при лизисе извне фаг не размножается, и количество его частиц не увеличи­вается.

По характеру действия на микроорганизмы различают вирулентные и умеренные фаги.

Вирулентные фаги вызывают лизис зараженной клетки с выходом в окружающую среду большого количе­ства фаговых частиц, способных поражать новые клетки. При этом культура микроорганизмов лизируется. Жидкая среда становится прозрачной - происходит образование фаголизата - среды, в которой находится большое количество фагов. При развитии вирулентного фага в бактериях, растущих на плотной среде, образуются или прозрачные участки сплошного лизиса, или вырастают отдельные прозрачные образования - колонии фага. Их называют негативными колониями (бляшками). Колонии - разных фагов отличаются по величине и структуре.

Умеренные фаги лизируют не все клетки в популя­ции. С частью из них фаги вступают в симбиоз: нуклеиновая кислота фага (его геном) встраивается в хромосому клетки и получает название про Фаг. Проис­ходит образование единой хромосомы. Бактериальная клетка при этом не погибает. Профаг, ставший частью генома клетки, при ее размножении может передаваться неограниченному числу потомков, т. е. новым клеткам. Явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом (профагом) носит название л и з о г е н и я, а культура, в которой имеется про фаг, называется лизогенной. Это название отражает способность профага спонтанно поки­дать хромосому клетки и, переходя в цитоплазму, превра­щаться в вирулентный фаг. Те клетки культуры, в которых образовался вирулентный фаг, погибают (лизируются), остальные сохраняют лизогенность.

Схема основных этапов взаимодействия фага с бактери­альной клеткой.

1 – внедрение нуклеиновой кислоты фага в клерку; 2-молодые, размножающиеся

фаги; 3 -зрелые фаги; 4 - выделение фагов.

Лизогенные культуры по своим основным свойствам не отличаются от исходных, но они устойчивы к повторному заражению одноименным фагом. При действии на лизогенную культуру проникающего излучения (определенных доз и экспозиции рентгеновских, космических лучей), некоторых химических веществ и ряда других факторов продукция вирулентного фага и лизис им клеток культуры значительно увеличиваются.

Умеренные фаги могут принести вред микробиологиче­скому производству. Например, если штаммы-продуценты вакцин, антибиотиков и других биологических веществ оказываются лизогенными, существует опасность перехо­да умеренного фага в вирулентный, что повлечет за собой лизис производственного штамма.

Умеренные фаги являются мощным фактором измен­чивости микроорганизмов. Профаг может изменить некоторые свойства микробной культуры, например сделать ее способной к токсинообразованию, что наблюдается среди дифтерийных палочек, возбудителя скарлатины и др. Кроме того, переходя в вирулентную форму и лизируя клетку, фаг может захватить часть хромосомы клетки-хозяина и перенести эту часть хромосомы в другую клетку, где фаг снова перейдет в профаг, а клетка получит новые свойства.

Распространение фагов в природе повсеместное. Фаги встречаются там, где находятся чувствительные к ним микроорганизмы: в воде, почве, сточных водах, выделени­ях человека и животных и т. д. Почти все известные бактерии являются хозяевами специфических для них фагов.

Устойчивость фагов к физическим и химическим факто­рам выше, чем у вегетативных форм их хозяев. Фаги выдерживают нагревание до.75°С, длительное высушива­ние, рН от 2,0 до 8,5. Они не чувствительны к антибиоти­кам, тимолу, хлороформу и ряду других веществ, уничто­жающих сопутствующую микрофлору. Поэтому эти веще­ства используют при выделении и сохранении фагов. Кислоты и дезинфицирующие вещества губительны для фагов.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ФАГОВ

Применение фагов основано на их строгой специфично­сти и способности разрушать микробные клетки или вступать с ними в симбиоз.

Фагопрофилактика и фаготерапия-предупреждение и лечение инфекций с помощью фагов основаны на том, что, встречая в организме больного возбудителя болезни, фаг уничтожает его. В настоящее время фаги широко применяют при лечении и профилактике стафилококковых и стрептококковых поражений, даже таких, которые не поддаются действию антибиотиков, а также холеры, чумы и ряда других инфекций, например, инфекций, вызванных кишечной палочкой и протеем.

Фагодиагностика включает: а) идентификацию выде­ленных культур с помощью известных (диагностических) фагов. Культура соответствует тому фагу, который ее лизировал. Например, если лизис вызвал холерный фаг, то это культура холерного вибриона. Строгая специфич­ность типовых фагов дает возможность типировать вари­анты внутри вида (фаговары). Фаготипирование имеет большое значение в эпидемиологии, так как позволяет установить источник инфекции и решить ряд других вопросов; б) определение неизвестного фага по тест-культуре микробов. Если фаг лизирует культуру возбудителя дизентерии, то это дизентерийный фаг; в) ускоренный метод диагностики с помощью реак­ции нарастания титра фага РНТФ не требует выделения чистой культуры возбудителя. Исследуемый материал (от больного или из объектов внешней среды) и индикаторный фаг, титр которого строго установлен, вносят в бульон.

Умеренные фаги широко применяют при решении кардинальных вопросов биологии. С их помощью изучен генетический код, достигнуты большие успехи в генной инженерии, их используют для изучения опухолевого роста, как фактор изменчивости микроорганизмов и в других исследованиях. Так как лизогенные культуры в отличие от «здоровых» чувствительны к радиации, они служат для определения надежности защиты космических кораблей от космических лучей: при ненадежной защите профаг переходит в вирулентную форму и лизирует культуру.

ПРЕПАРАТЫ ФАГОВ

При производственном получении препаратов фага пользуются хорошо изученными штаммами микроорганизмов и фагов, которые обычно выращивают в реакторах, что позволяет получать большие количества фаголизата.

Фаги выпускают в жидком виде (ампулы и флаконы), в таблетках и свечах. Таблетка фагов, предназначенные для применения через рот, покрыты кислотоустойчивой оболочкой, защищающей фаги от действия соляной кислоты желудочного сока.

Все препараты фагов подлежат обязательному контролю на отсутствие посторонней флоры, безвредность и активность (титр), который осуществляется на выпускающем их производстве. Выборочный контроль производят в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Выпускаемый фаг снабжен этикеткой, на которой указано: учреждение, его выпускающее, название фага, серия, номер контроля и срок годности. Каждая упаковка снабжена наставлением по применению и хранению фага.

Ферменты - это катализаторы химических реакций белковой природы, отличающиеся специфичностью действия в отношении катализа определенных химических реакций. Они являются продуктами биосинтеза всех живых почвенных организмов: древесных и травянистых растений, мхов, лишайников, водорослей, микроорганизмов, простейших, насекомых, беспозвоночных и позвоночных животных, представленных в природной обстановке определенными совокупностями - биоценозами.

Биосинтез ферментов в живых организмах осуществляется благодаря генетическим факторам, ответственным за наследственную передачу типа обмена веществ и его приспособительную изменчивость. Ферменты являются тем рабочим аппаратом, при помощи которого реализуется действие генов. Они катализируют в организмах тысячи химических реакций, из которых в итоге слагается клеточный обмен. Благодаря им химические реакции в организме осуществляются с большой скоростью.

В настоящее время известно более 900 ферментов. Их подразделяют на шесть главных классов.

1. Оксиредуктазы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции.

2. Трансферазы, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных химических групп и остатков.

3. Гидролазы, катализирующие реакции гидролитического расщепления внутримолекулярных связей.

4. Лиазы, катализирующие реакции присоединения групп по двойным связям и обратные реакции отрыва таких групп.

5. Изомеразы, катализирующие реакции изомеризации.

6. Лигазы, катализирующие химические реакции с образованием связей за счет АТФ (аденозинтрифосфорной кислоты).

При отмирании и перегнивании живых организмов часть их ферментов разрушается, а часть, попадая в почву, сохраняет свою активность и катализирует многие почвенные химические реакции, участвуя в процессах почвообразования и в формировании качественного признака почв - плодородия. В разных типах почв под определенными биоценозами сформировались свои ферментативные комплексы, отличающиеся активностью биокаталитических реакций.

В. Ф. Купревич и Т. А. Щербакова (1966) отмечают, что важной чертой ферментативных комплексов почв является упорядоченность действия имеющихся групп ферментов, которая проявляется в том, что обеспечивается одновременное действие ряда ферментов, представляющих различные группы; исключаются образование и накопление соединений, имеющихся в почве в избытке; излишки накопившихся подвижных простых соединений (например, NH 3) тем или иным путем временно связываются и направляются в циклы, завершающиеся образованием более или менее сложных соединений. Ферментативные комплексы являются уравновешенными саморегулирующимися системами. В этом основную роль играют микроорганизмы и растения, постоянно пополняющие почвенные ферменты, так как многие из них являются короткоживущими. О количестве ферментов косвенно судят по их активности во времени, которая зависит от химической природы реагирующих веществ (субстрата, фермента) и от условий взаимодействия (концентрации компонентов, рН, температуры, состава среды, действия активаторов, ингибиторов и т.д.).

В данной главе рассматривается участие в некоторых химических почвенных процессах ферментов из класса гидролаз - активность инвертазы, уреазы, фосфатазы, протеазы и из класса оксиредуктаз - активность каталазы, пероксидазы и полифенолоксидазы, имеющих большое значение в превращении азот- и фосфорсодержащих органических веществ, веществ углеводного характера и в процессах образования гумуса. Активность этих ферментов - существенный показатель плодородия почв. Кроме того, будет охарактеризована активность этих ферментов в лесных и пахотных почвах разной степени окультуренности на примере дерново-подзолистых, серых лесных и дерново-карбонатных почв.

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВЕННЫХ ФЕРМЕНТОВ

Инвертаза - катализирует реакции гидролитического расщепления сахарозы на эквимолярные количества глюкозы и фруктозы, воздействует также на другие углеводы с образованием молекул фруктозы - энергетического продукта для жизнедеятельности микроорганизмов, катализирует фруктозотрансферазные реакции. Исследования многих авторов показали, что активность инвертазы лучше других ферментов отражает уровень плодородия и биологической активности почв.

Уреаза- катализирует реакции гидролитического расщепления мочевины на аммиак и диоксид углерода. В связи с использованием мочевины в агрономической практике необходимо иметь в виду, что активность уреазы выше у более плодородных почв. Она повышается во всех почвах в периоды их наибольшей биологической активности - в июле - августе.

Фосфатаза (щелочная и кислая) - катализирует гидролиз ряда фосфорорганических соединений с образованием ортофосфата. Активность фосфатазы находится в обратной зависимости от обеспеченности растений подвижным фосфором, поэтому она может быть использована как дополнительный показатель при установлении потребности внесения в почвы фосфорных удобрений. Наиболее высокая фосфатазная активность в ризосфере растений.

Протеазы - это группа ферментов, при участии которых белки расщепляются до полипептидов и аминокислот, далее они подвергаются гидролизу до аммиака, диоксида углерода и воды. В связи с этим протеазы имеют важнейшее значение в жизни почвы, так как с ними связаны изменение состава органических компонентов и динамика усвояемых для растений форм азота.

Каталаза - в результате ее активирующего действия происходит расщепление перекиси водорода, токсичной для живых организмов, на воду и свободный кислород. Большое влияние на каталазную активность минеральных почв оказывает растительность. Как правило, почвы, находящиеся под растениями с мощной глубоко проникающей корневой системой, характеризуются высокой каталазной активностью. Особенность активности каталазы заключается в том, что вниз по профилю она мало изменяется, имеет обратную зависимость от влажности почв и прямую - от температуры.

Полифенолоксидаза и пероксидаза - им в почвах принадлежит важная роль в процессах гумусообразования. Полифенолоксидаза катализирует окисление полифенолов в хиноны в присутствии свободного кислорода воздуха. Пероксидаза же катализирует окисление полифенолов в присутствии перекиси водорода или органических перекисей. При этом ее роль состоит в активировании перекисей, поскольку они обладают слабым окисляющим действием на фенолы. Далее может происходить конденсация хинонов с аминокислотами и пептидами с образованием первичной молекулы гуминовой кислоты, которая в дальнейшем способна усложняться за счет повторных конденсаций (Кононова, 1963).

Замечено (Чундерова, 1970), что отношение активности полифенолоксидазы (S) к активности пероксидазы (D), выраженное в процентах (), имеет связь с накоплением в почвах гумуса, поэтому эта величина получила название условный коэффициент накопления гумуса (К). У пахотных слабоокультуренных почв Удмуртии за период с мая по сентябрь он составил: у дерново-подзолистой - 24 %, у серой лесной оподзоленной - 26 и у дерново-карбонатной почвы - 29 %.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ В ПОЧВАХ

Биокаталитическая активность почв находится в значительном соответствии со степенью обогащенности их микроорганизмами (табл. 11), зависит от типа почв и изменяется по генетическим горизонтам, что связано с особенностями изменения содержания гумуса, реакции, Red-Ox-потенциала и других показателей по профилю.

В целинных лесных почвах интенсивность ферментативных реакций в основном определяют горизонты лесной подстилки, а в пахотных - пахотные слои. Как в одних, так и в других почвах все биологически менее активные генетические горизонты, находящиеся под горизонтами А или А п, имеют низкую активность ферментов, незначительно изменяющуюся в положительную сторону при окультуривании почв. После освоения лесных почв под пашню ферментативная активность образованного пахотного горизонта по сравнению с лесной подстилкой оказывается резко сниженной, но по мере его окультуривания повышается и в сильно окультуренных видах приближается или превышает показатели лесной подстилки.

11. Сопоставление биогенносга и ферментативной активности почв Среднего Предуралья (Пухидская, Ковриго, 1974)

№ разреза, название почвы	Горизонт, глубина взятия образца, см		Общее количество микроорганизмов, тыс. на 1 г абс. сух. почвы (в среднем за 1962, 1964-1965 гг.)	Показатели активности ферментов (в среднем за 1969-1971 гг.)
				Инвертаза, мг глюкозы на 1 г почвы за I сут	Фосфатаза, мг фенолфталеина на 100 г почвы за 1 ч	Уреаза, мг NH, нa 1 г почвы за 1 сут	Каталаза, мл 0 2 на 1 г почвы за 1 мин	Полифенолоксидаза		Пероксидаза
								мг пурпурогаллина на 100 г почвы
3. Дерново-среднеподзолистая среднесуглинистая (под лесом)
					Не определяли
1.Дерново-средне-подзолистая средне-суглинистая слабоокультуренная
10.Сераялесная оподзоленная тяжел осуглинистая слабоокультуренная
2. Дерново-карбонатная слабовыщело-ченная л егкосуглинистая слабоокультуренная

Активность биокаталитических реакций почв изменяется. Наименьшая она весной и осенью, а наиболее высокая обычно в июле-августе, что соответствует динамике общего хода биологических процессов в почвах. Однако в зависимости от типа почв и их географического положения динамика ферментативных процессов весьма различна.

Контрольные вопросы и задания

1. Какие соединения называют ферментами? Каковы их продуцирование и значение для живых организмов? 2. Назовите источники почвенных ферментов. Какую роль играют отдельные ферменты в почвенных химических процессах? 3. Дайте понятие о ферментативном комплексе почв и его функционировании. 4. Дайте общую характеристику течения ферментативных процессов в целинных и пахотных почвах.