Okratoksinlar hosil qiluvchi zamburug'lar Aspergillus va Penicillium avlodiga mansub zamburug'lardir. A. ochraceus qo'ziqorinining chiqindilarining o'rdaklar uchun zaharliligi to'g'risida birinchi hisobot 1965 yilda Skott tomonidan qilingan. Keyingi yillarda ushbu qo'ziqorin chiqindilarini sof shaklda ajratish, deshifrlash bo'yicha ko'plab tadqiqotlar o'tkazildi. ajratilgan mikotoksinlarning kimyoviy tuzilishi, ularning biologik faolligi, toksin hosil bo'lish sharoitlari, turli biologik substratlarda aniqlash usullarini o'rganish. Okratoksinlar ushbu mikotoksinning birinchi ishlab chiqaruvchisi bo'lgan qo'ziqorin turiga atalgan.

A. ochraceus zamburugʻining kulturasidan toʻrtta oxratoksin ajratilgan – A, B, C va D. Oxratoksin A eng katta sanitariya-toksikologik ahamiyatga ega, aseton, benzol, asetonitril, xloroform va spirtlarda yaxshi eriydi. Temir xlorid bilan o'zaro ta'sirlashganda qizil rangli kompleks, ishqorlar bilan kuchli komplekslar hosil qiladi.

Okratoksinlar hosil qiluvchi asosiy zamburugʻlar A. ochraceus va P. vedicatum hisoblanadi. Iliq iqlimi boʻlgan mamlakatlarda yem koʻpincha A. ochraceus qoʻziqorinidan, moʻʼtadil iqlimli mamlakatlarda P. vedicatum zamburugʻidan oxratoksin bilan zaharlanadi. Ekish vaqtida eng katta toksin hosil bo'ladigan substratning optimal harorati A. ochraceus qo'ziqorinlari uchun 28 ° C va P. vedicatum qo'ziqorinlari uchun 20 ° C dir.

N.V.Volkov (1980) ma'lumotlariga ko'ra, Ukrainadagi beshta cho'chqachilik kompleksida ajratilgan 316 zamburug' izolyatridan 106 shtamm (33,5%) A. ochraceus zamburug'lari sifatida tasniflangan. Ushbu miqdordan to'rtta izolat oxratoksin A hosil qildi.

Zamburug'lar - okratoksin A ishlab chiqaruvchilari - ko'pincha Rossiyada ozuqada uchraydi, ammo hayvonlar kasalligining juda kam holatlari qayd etilgan. Bu ozuqa tarkibidagi okratoksin A ni aniqlashning sezgir va o'ziga xos usuli yo'qligi bilan bog'liq. So'nggi paytlarda Kursk va Belgorod viloyatlaridagi bir qator cho'chqachilik xo'jaliklarida okratoksikoz A aniqlangan (G. P. Kononenko va boshqalar, 1999).

Okratoksinlar, boshqa mikotoksinlar kabi, hayvonlar organizmida nisbatan tez yo'q qilinadi. Biroq, dozaga qarab, mikotoksin cho'chqalarning mushak to'qimalari va mushaklarida 2 haftagacha, jigarda 3 haftagacha va buyraklarda 4 haftagacha qolishi mumkinligi haqida xabarlar mavjud. Shuning uchun, mikotoksinning tanaga kirgan oxirgi holatidan keyin hayvonlarni so'yish muddatini 4 hafta ichida belgilash kerak. Bundan tashqari, mikotoksin nisbatan ko'p miqdorda ozuqa orqali qabul qilinsa, sutda ajralib chiqishi mumkin.

Oxratoksin A deganda juda zaharli birikmalar tushuniladi - LD5o laboratoriya hayvonlari uchun bir marta og'iz orqali yuborish hayvonlarning vazniga 20-28 mg/kg, 7 kunlik tovuqlar uchun 11-15 mt/kg. Mikotoksin aniq to'planishini namoyon qiladi. Cho'chqalar, ayniqsa yoshlar, unga eng sezgir, keyin qushlar.

Ozuqa tarkibidagi mikotoksin miqdori 0,2-0,4 mg/kg yem bo‘lganda, cho‘chqalar, hatto uzoq vaqt boqishda ham, zaharlanishning klinik belgilari kuzatilmagan, lekin hayvonlarning vazni ortishi va poliuriyaning kamayishi kuzatilgan. Tovuqlar uchun subtoksik doza 0,6-0,8 mg/kg yem, zaharli dozasi 1,5-2,0 mg/kg. Oziq-ovqat tarkibidagi oxratoksin A ning miqdori 5 mg/kg ga oshganda, cho'chqa va tovuqlarda alohida hayvonlarning zaharlanishi va o'limi belgilari aniqlandi.

Toksikodinamika. Yetarlicha aniq emas. Okratoksin A birinchi navbatda buyraklarga ta'sir qiladi, shuning uchun bu mikotoksikoz birinchi marta cho'chqalarda qayd etilgan Daniyada "cho'chqa mikotoksik nefropatiyasi" deb nomlangan. Okratoksinlar qonga kirib, uning oqsillari bilan nisbatan tez bog'lanishi aniqlandi. Ehtimol, buyraklarning kislotali muhitiga kirib, mikotoksin chiqariladi va uning nefropatik ta'sirini ko'rsatadi.

Klinika. Amaliy sharoitda tez-tez uchraydigan surunkali okratoksikoz juda zaif tarzda namoyon bo'ladi. Hayvonlarda tashnalik kuchayadi, poliuriya namoyon bo'ladi va vazn ortishi kamayadi. Ba'zi hollarda qonda leykotsitoz, limfotsitlar sonining ko'payishi va bazofillarning kamayishi qayd etiladi. Tovuqlarda umumiy tushkunlik, tuklar jingalak, mahsuldorlikning pasayishi kuzatiladi. Ba'zi mualliflarning fikriga ko'ra, tuxum qobig'ida sariq dog'lar paydo bo'ladi.

Davolash. Muayyan davolash usullari mavjud emas. Avvalo, oxratoksin A bo'lgan yoki mog'or bilan ifloslangan ozuqani dietadan chiqarib tashlash kerak. Ozuqa turli adsorbentlarni, masalan, seolitlarni, glaukoniylarni va boshqalarni kiritish samaralidir.

Patologik o'zgarishlar. Okratoksikozning eng keng tarqalgan alomati buyrakning shikastlanishidir. Qoida tariqasida, ular kattalashgan, kapsula ba'zi joylarda korteks bilan bog'langan. Bo'limda korteks rangpar; kapsula ostida 1 - 2 mm gacha bo'lgan kistalar bo'lishi mumkin. Gistologik tekshiruvda proksimal tubula hujayralarining nekrozi, kortikal qatlamda biriktiruvchi to'qimalarning ko'payishi aniqlanadi.

Ba'zida qorin bo'shlig'ida suyuqlik miqdori ko'payadi. Ba'zi hollarda jigar kattalashadi va uning hujayralari nekrozga uchraydi.

Veterinariya ekspertizasi. Okratoksikozda hayvonlarni majburiy so'yishda a'zolar va to'qimalar, ayniqsa buyraklar, mikotoksin borligini tekshirish kerak. Go'sht va sut mahsulotlaridagi oxratoksin uchun MRL o'rnatilmagan. Agar mikotoksin qoldiqlari aniqlansa, tana go'shti va ichki organlar utilizatsiya qilinadi.

Varaqa

To'plamlar ferment immunoassay uchun test tizimlari. Ular ISO 9000 standartiga muvofiq ommaviy ishlab chiqariladi va zarur reagentlar bilan to'la bo'lib, don, ozuqa, don mahsulotlari, pivo va qon zardobidagi oxratoksinni miqdoriy aniqlash uchun mo'ljallangan. Test tizimlaridan foydalanish bo'yicha ko'rsatmalar RIDASCREEN ® FAST Okratoksin A Va RIDASCREEN ® Okratoksin A soni ostida Rossiya Qishloq xo'jaligi vazirligining Qishloq xo'jaligi Federal agentligining veterinariya boshqarmasi tomonidan tasdiqlangan. MUK 5-1-14/1001. Tizimlar “Davlat veterinariya laboratoriyalarida hayvonlar, baliqlar, asalarilar kasalliklarini diagnostikasi, shuningdek hayvonot va oʻsimlik xom ashyosi xavfsizligini nazorat qilish uchun foydalanish uchun tasdiqlangan normativ hujjatlar roʻyxati”ga kiritilgan. Sinov tizimlari RIDASCREEN ® FAST Okratoksin A mos keladi GOST 34108-2017"Ozuqa, aralash ozuqa, ozuqa xomashyosi. To'g'ridan-to'g'ri qattiq fazali raqobatbardosh ferment immunoassay orqali mikotoksin tarkibini aniqlash."

Don, yem, don mahsulotlari, pivo va qon zardobida oxratoksin A ni aniqlash

Okratoksin - bu jinsning mog'or qo'ziqorinlari faoliyati natijasida hosil bo'lgan zaharli modda Aspergillus Va Penitsilium. Okratoksin kuchli nefrotoksiklik bilan bir qatorda gepatotoksik, teratogen, kanserogen va immunosupressiv xususiyatlarga ega. Okratoksin inson tanasiga o'simlik va hayvonlardan olingan mahsulotlar bilan kirishi mumkin. U nafaqat don ekinlarida (musbat namunalarning 13%) va chorva ozuqalarida, balki cho'chqa qonida (musbat namunalarning 60%) va buyraklarda (musbat namunalarning 21%) ham uchraydi.

Bojxona ittifoqining texnik reglamenti TR CU 021/2011 "Oziq-ovqat mahsulotlarining xavfsizligi to'g'risida" okratoksin A tarkibining quyidagi maksimal darajasini tartibga soling: oziq-ovqat donlarida, donlarda, unda - 0,005 mg / kg (5 mkg / kg); bolalar ovqatlarida, maktabgacha va maktab o'quvchilari uchun oziq-ovqat mahsulotlarida, homilador va emizikli ayollar uchun oziq-ovqat mahsulotlarida - ruxsat etilmaydi (<0,0005 мг/кг).

Federal qonun loyihasi № 349084-5 "Sharob mahsulotlari uchun texnik reglament" sharob tarkibidagi okratoksin A ning 0,002 mg / l dan oshmaydigan tarkibiga qo'yiladigan talablarni belgilaydi.

"Oziq-ovqat mahsulotlarining xavfsizligi va ularni ishlab chiqarish, saqlash, tashish, sotish va yo'q qilish jarayonlariga qo'yiladigan talablar to'g'risida" Federal qonun loyihasi, shuningdek, tarkibi 0,005 dan oshmasligi kerak bo'lgan okratoksin A uchun oziq-ovqat donalarini majburiy nazorat qilish talabini o'z ichiga oladi. mg/kg. Amaldagi qonunchilik qoidalarini veb-saytda topish mumkin compact24.com.

Yaqin vaqtgacha oxratoksinni kuzatish uchun asosan xromatografik usullar (yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi, yupqa qatlamli xromatografiya) ishlatilgan. Juda ham qulay usul - bu juda yuqori sezuvchanlikka ega bo'lgan ferment bilan bog'liq immunosorbent tahlili (ELISA yoki Elishay).

Spetsifikatsiya:	RIDASCREEN ® FAST Okratoksin A	RIDASCREEN ® Okratoksin A 30/15
Format:	Chiziq plitasi, 48 ta quduq (8 ta quduqdan 6 ta chiziq)	Chiziq plitasi, 96 ta quduq (8 ta quduqning 12 ta chizig'i)
Standartlar:	0/5/10/20/40 mkg/l	0/50/100/300/900/1800 ng/l
Namuna tayyorlash:	Namunani maydalash, ajratib olish, filtrlash	ekstraksiya, sentrifugalash/filtrlash (don, yem); ekstraksiya, santrifüjlash, filtrlash, chayqash, haddan tashqari ekstraksiya, sentrifugalash, bug'lanish (pivo/qon zardobi)
Vaqt xarajatlari:
Aniqlash chegarasi:	0,005 mg/kg	0,001250 mg/kg (don, yem) 0,000050 mg/kg (pivo, qon zardobi)

Tegishli mahsulotlar:

Okratoksinlar qo'ziqorinlarning ayrim turlari tomonidan ishlab chiqariladi Aspergillus Va Penitsilium. Asosiy ishlab chiqaruvchilar A.ochraceus Va P. viridicatum. Bu qo'ziqorinlarni hamma joyda topish mumkin. Aspergillus yuqori harorat va namlikda oxratoksinlar hosil qiladi va Penitsilium allaqachon 5ºS da. Okratoksinlar aniq teratogen ta'sirga ega bo'lgan juda zaharli birikmalardir.

Okratoksinlar A, B va C - bu izokumarinlar bilan bog'liq bo'lgan tarkibiy jihatdan o'xshash birikmalar guruhi. L- fenilalanin peptid aloqasi. Radikallarning tabiatiga qarab har xil turdagi oxratoksinlar hosil bo'ladi (2.3-jadval).

Okratoksin A rangsiz kristall moddadir, suvda ozgina eriydi, qutbli organik erituvchilarda (metanol, xloroform), shuningdek natriy karbonatning suvdagi eritmasida o'rtacha eriydi. Kimyoviy sof shaklida u beqaror va yorug'lik va havoga juda sezgir, ammo etanol eritmasida u uzoq vaqt davomida o'zgarishsiz qolishi mumkin. UV nurida u yashil floresansga ega.

Okratoksin B kristalli modda bo'lib, xlor atomini o'z ichiga olmaydi. U oxratoksin A dan taxminan 50 marta kamroq zaharli. U ultrabinafsha nurda ko'k rangda lyuminestsatsiyalanadi.

Okratoksin C amorf modda, oxratoksin A ning etil esteri bo'lib, toksikligi bo'yicha unga yaqin, ammo oziq-ovqat va ozuqaning tabiiy ifloslantiruvchisi sifatida topilmagan. U-nurida u och yashil floresanga ega.

Okratoksinlar toksik mikotoksinlarga tegishli, jigar, buyraklar uchun yuqori toksiklik, teratogen va immunosupressiv xususiyatlarga ega va aniq gemolitik ta'sirga ega. Okratoksinlardan eng zaharlisi oxratoksin A (LD 50 = 3,4 mg/kg, (bir kunlik jo'jalar, og'iz orqali)). Aflatoksinlarga qaraganda zaharliroqdir. Ushbu guruhdagi boshqa mikotoksinlar toksikligi kamroq.

Okratoksinlarning biokimyoviy, molekulyar va hujayraviy ta’sir mexanizmlari yetarlicha o‘rganilmagan. Ma'lumki, oxratoksin A oqsil sintezi va uglevod almashinuvini, xususan, glikonogenezni bostiradi, oqsil sintezining dastlabki bosqichida asosiy rol o'ynaydigan o'ziga xos ferment - t-RNK - fenilalanin faolligini inhibe qiladi.

Okratoksin A makkajo'xori, arpa, bug'doy, suli va arpada mavjud. Muhim va xavfli fakt shundan iboratki, ozuqa donlari va yemlar yuqori darajada ifloslangan bo'lsa, chorvachilik mahsulotlarida (jambon, bekon, kolbasa) oxratoksin A topiladi. Okratoksin B kam uchraydi. Okratoksinlar bog'dorchilik ekinlarining barcha mevalariga ham ta'sir qiladi. Olma ayniqsa qattiq ta'sir qiladi: hosilning 50% gacha mikotoksinlar bilan ifloslangan bo'lishi mumkin.

Shuni ta'kidlash kerakki, oxratoksinlar barqaror birikmalardir. Masalan, oxratoksin A bilan ifloslangan bug'doyni uzoq vaqt qizdirish bilan uning tarkibi atigi 32% ga kamaydi (250-300ºS haroratda). Shunday qilib, oziq-ovqat mahsulotlarida tarqalishi, oxratoksinlarning toksikligi va chidamliligi inson salomatligi uchun haqiqiy xavf tug'diradi.

Tahlil usullari

Okratoksin A oksidlangan ovqatlarda mavjud. Ekstraktsiya uchun ishlatiladigan ko'plab organik erituvchilarda oson eriydi. Eng ko'p qo'llaniladigan xloroform va fosfor kislotasining suvli eritmasi bilan ekstraktsiya, keyin esa TLC usuli yordamida ustunlarni tozalash va miqdorni aniqlash.

HPLC usuli ham ishlab chiqilgan. HPLC tahlilidan oldin namuna quyidagi tarzda tayyorlanadi. Ezilgan namuna 2 M xlorid kislota aralashmasi va 0,4 M magniy xlorid eritmasi bilan ishlov beriladi. Gomogenlashtirgandan so'ng, 60 daqiqa davomida toluol bilan ekstrakt. Aralash sentrifuga qilinadi. Tsentrifugat silikagel kolonkasidan o'tkaziladi va toluol va aseton aralashmasi (mobil faza) bilan yuviladi. Oxratoksin A toluol va sirka kislota aralashmasi (9:1) bilan suziladi va 40°C da quritiladi. Qoldiq eritiladi va filtrlanadi. Tahlil HPLC yordamida amalga oshiriladi.

Bundan tashqari, qisqichbaqalar va bakteriyalarda bir qator bioassaylar ishlab chiqilgan, ammo olingan natijalar oxratoksinlarni aniqlash uchun ushbu usullardan foydalanishga imkon bermadi.



Namunadagi okratoksin A ning konsentratsiyasi, mg/kg

Nisbiy xato chegaralari (aniqlik ko'rsatkichi) (±d), %, R = 0,95

Takroriylik standart og'ishi (s r), %

Takrorlanish chegarasi ( r), %

Moddani ajratib olishning to'liqligi, %

4.2. Yordamchi uskunalar

AVU-6S tipidagi yoki shunga o'xshash namunalarni silkitish uchun moslama
Qopqonli yoki shunga o'xshash IR-1M aylanadigan bug'lantiruvchi
50 dan 350 ° C gacha bo'lgan haroratni saqlash xatosi ± 2,5 bo'lgan elektr laboratoriya quritish shkafi
Uy muzlatgichi
EM-3A elektr laboratoriya tegirmoni yoki shunga o'xshash pH o'lchagich	TU 46-22-236-79
MM 5 tipidagi magnit aralashtirgich, aralashtirgichli	TU 25-11.834-80
KnKSh 250-29/32 tipidagi NSh 29 bilan 250 sm3 hajmli tekis tubli konussimon kolbalar	GOST 10394-74
To'q rangli shishadan yasalgan vidalanadigan shisha butilkalar (yomon), hajmi 7 sm3
O'lchov kolbalari, sig'imi 100, 500, 1000 sm3 2-100-2,2-500-2
Laboratoriya voronkalari
GrKSh-10-14/23 tipidagi NSh 14,5 li nok shaklidagi kolbalar 10 sm3.	GOST 10394-72

4.3. Reaktivlar va materiallar

. O'lchovlarni olishga tayyorgarlik

5.1. Okratoksin A ning standart eritmalarini tayyorlash

Standart saqlash eritmasini tayyorlash uchun (oxratoksin A kontsentratsiyasi 10 ng/mkl) 5 mg kristalli okratoksin A namunasi 500 sm3 hajmli o‘lchov kolbasiga, 50 sm3 toluol-sirka kislotasi aralashmasiga (98:2% hajmli) solinadi. ) qo'shiladi, modda to'liq eriguncha yaxshilab aralashtiriladi va bir xil erituvchilar aralashmasini belgiga keltiriladi. Saqlash eritmasining aniq konsentratsiyasini aniqlash uchun uning optik zichligi 333 nm (D333) to'lqin uzunligida o'lchanadi. Eritmaning konsentratsiyasi quyidagi formula bo'yicha hisoblanadi:

Okratoksin A ning 0,005 konsentratsiyali ishchi eritmalarini tayyorlash; 0,05 va 0,1 ng/ml, konsentratsiyasi 0,5 ng/ml bo‘lgan eritmadan mos ravishda 50, 500 va 1000 mkl olib, quruq bo‘lguncha bug‘lanadi va harakatlanuvchi fazaning 5 sm3 qismida eritiladi.

Okratoksin A saqlash eritmasi bir yilgacha qorong'i, salqin joyda (taxminan 0 ° C haroratda) maydalangan tiqinli shisha idishda saqlanadi va ishchi standart eritmalarni tayyorlash uchun ishlatiladi. Ishlaydigan standart eritmalar qorong'i shisha flakonlarda 1 oy davomida qorong'i va salqin joyda (taxminan 0 ° C haroratda) saqlanadi.

Ishlaydigan standart echimlarni ishlatishdan oldin ularni xona haroratiga etkazish kerak va shundan keyingina qopqoqlarni ochish kerak.

5.2. Fosfat bufer eritmasini tayyorlash, pH = 7,4

Og'irligi 1,15 g bo'lgan natriy fosfat 12-suv namunasi, og'irligi 0,124 g bo'lgan natriy mono-almashtirilgan 2-suv va og'irligi 1,74 g natriy xlorid namunasi sig'imi 1010 sm3 bo'lgan o'lchov kolbasiga o'tkaziladi, unga qo'shing. sm3 distillangan suv. Aralashtiring va kolbadagi eritma hajmini belgiga moslang. Yaroqlilik muddati: muzlatgichda 1 oy.

5.3. Erituvchi aralashmalarni tayyorlash

Toluol-sirka kislota (98:2 % haqida.).

1000 sm 3 hajmli o‘lchov kolbasiga 20 sm 3 sirka kislota qo‘shing va aralashtirib, toluol bilan belgiga sozlang. Yaroqlilik muddati: salqin, qorong'i joyda 1 oy.

Asetonitril-suv (60:40 % haqida.).

Hajmi 1000 sm3 bo‘lgan o‘lchov kolbasiga 600 sm3 atsetonitril qo‘shing va aralashtirganda belgigacha suv qo‘shing. Yaroqlilik muddati: salqin, qorong'i joyda 1 oy.

Asetonitril-suv (60:40 % haqida.; pH = 3 ,0 ).

1000 sm3 hajmli o‘lchov kolbasiga 600 sm3 atsetonitril qo‘shing va aralashtirib, ikki marta distillangan suv bilan belgigacha keltiring. Fosfor kislotasini qo'shib, aralashmaning pH qiymati 3,0 qiymatiga o'rnatiladi. Yaroqlilik muddati: salqin, qorong'i joyda 1 oy.

Metanol-sirka kislota (98:2 % haqida.).

1000 sm 3 hajmli o'lchov kolbasiga 20 sm 3 sirka kislota qo'shing va aralashtirib, metanol bilan belgiga keltiring. Yaroqlilik muddati: salqin, qorong'i joyda 1 oy.

. Tahlil uchun namunalarni tanlash va tayyorlash

6.1. Namuna olish

Muayyan turdagi mahsulotlardan namuna olishning o'ziga xos xususiyatlarini hisobga olish uchun amaldagi me'yoriy-texnik hujjatlarga amal qilish kerak:

"Makkajo'xori. Qabul qilish qoidalari va namuna olish usullari" GOST 13586.3-83;

“Yormalar. Qabul qilish qoidalari va namuna olish usullari" GOST 26312.1-84;

“Un va kepak. Qabul qilish va namuna olish usullari" GOST 27668-88;

“Konservalangan oziq-ovqat mahsulotlari. Namuna olish va ularni sinovga tayyorlash" GOST 8756.0-70.

Butun lot uchun mikotoksin kontsentratsiyasini ifodalovchi tahlil uchun namunalar 2 kg og'irlikdagi oldindan gomogenlashtirilgan o'rtacha (dastlabki) namunadan olinishi kerak.

6.2. Namunalarni tahlil qilish uchun tayyorlash

Tanlangan namunalar laboratoriya tegirmonida 1-2 daqiqa davomida maydalanadi. Bunday holda, ikkita parallel namunalar qo'llaniladi.

6.2.1. Ekstraksiya

25 g hajmli maydalangan namuna namunasi 250 sm, tubi tekis bo‘lgan konussimon kolbaga solinadi va unga 100 sm3 atsetonitril-suv aralashmasi (60:40 % hajm) qo‘shiladi. 30 daqiqa davomida namunali silkitgich yordamida ekstrakti. Olingan aralash ko'k lenta katlanmış qog'oz filtri orqali filtrlanadi. 10 sm3 filtrat olib, 90 sm fosfat bufer eritmasi qo'shing, pH = 7,4.

6.2.2. Ekstraktni tozalash

Olingan aralashmadan 100 ml immunoaffinite ustuniga sekundiga 1 - 2 tomchi tezlikda surtiladi, 20 sm3 fosfat bufer eritmasi bilan yuviladi, pH = 7,4. Oxratoksin A 3 sm3 metanol-sirka kislotasi aralashmasi (98: 2% hajm) bilan suziladi.

. O'lchovlarni olish

7.1. Sinov namunasini tayyorlash

Eluat quruq bo'lgunga qadar bug'lanadi. Quruq qoldiq 400 mkl mobil fazada (A eritmasi) eritiladi.

7.2. Xromatografiya shartlari

HPLC shartlari: mobil faza - asetonitril-suv (60:40% hajm; pH = 3,0); mobil faza tezligi - 1,5 sm3 / min.

Ftorimetrik detektor 333 nm hayajonli radiatsiya to'lqin uzunligiga o'rnatiladi va emissiya chizig'ida 466 nm o'tish diapazoni bo'lgan emissiya filtri o'rnatiladi.

Namunalarni tahlil qilish uchun mikroshprits yordamida xromatograf injektoriga 50 mkl sinov namunasi (A eritmasi) yuboriladi. Agar oxratoksin A bilan ushlab turish vaqtida eng yuqori nuqta bo'lsa, in'ektsiyadagi oxratoksin A ning massasi kalibrlash grafigi yordamida hisoblanadi.

. O'lchov natijalarini qayta ishlash

8.1. Darajali munosabatlarni qurish

Kalibrlash egri chizig'ini qurish uchun standartlarning bir qator ishchi yechimlarining xromatografik tahlili o'tkaziladi. 0,005 ng/ml konsentratsiyali 50 mkl ishchi standart eritma mikroshprits yordamida injektorga yuboriladi, bu 0,25 ng okratoksin A ga to'g'ri keladi. Xuddi shu narsa 0,05 va 0,10 ng/ml konsentratsiyali boshqa standart eritmalar uchun ham bajariladi. , bu o'z navbatida inyeksiyada 2,5 va 5,0 ng oxratoksin A ga to'g'ri keladi. Bunday sharoitda oxratoksin A ni ushlab turish vaqti 4 dan 5 minutgacha. Olingan ma'lumotlarga asoslanib, kalibrlash grafigi tuziladi (xromatografik tepalik maydonining in'ektsiyadagi oxratoksin A massasiga bog'liqligi).

Tahlil natijasi shaklda taqdim etiladi (ehtimollik bilan R = 0,95):

D - mutlaq xato chegarasi:

d - texnikaning nisbiy xatosi chegarasi (aniqlik ko'rsatkichi), % (1-jadval).

* 0,0001 mg/kg - aniqlash chegarasi.

. Ijrochining malaka talablari

Don va g‘alla mahsulotlarida oxratoksin A tahlilini o‘tkazishga HPLC tahlil texnikasini egallagan, tegishli tayyorgarlikdan o‘tgan va kimyoviy laboratoriyada ish tajribasiga ega bo‘lgan maxsus oliy yoki o‘rta maxsus ma’lumotga ega bo‘lgan shaxslarga ruxsat etiladi.

. O'lchash shartlari

Atrof-muhit harorati 15 dan 25 ° C gacha.

25 ° C da nisbiy havo namligi 80% dan oshmaydi.

Atmosfera bosimi 730 - 760 mm Hg.

Quvvat manbai kuchlanishi: 210 - 220 V. AC chastotasi: 45 - 50 Hz.

Namunadagi okratoksin A ning konsentratsiyasi, mg/kg

Nisbiy xato chegaralari (aniqlik ko'rsatkichi) (±d), %, R = 0,95

Takroriylik standart og'ishi (s r), %

Takrorlanish chegarasi ( r), %

Moddani ajratib olishning to'liqligi, %

4. O'lchov asboblari, yordamchi asboblar, shisha idishlar, reaktivlar va materiallar

4.1. O'lchov asboblari

4.2. Yordamchi uskunalar

AVU-6S tipidagi yoki shunga o'xshash namunalarni silkitish uchun moslama	TU 64-1-2451
Qopqonli yoki shunga o'xshash IR-1M aylanadigan bug'lantiruvchi	TU 25-11917
50 dan 350 ° C gacha bo'lgan haroratni saqlash xatosi ± 2,5 bo'lgan elektr laboratoriya quritish shkafi	TU 16-531.639
Uy muzlatgichi
EM-3A elektr laboratoriya tegirmoni yoki shunga o'xshash pH o'lchagich	TU 46-22-236-79
MM 5 tipidagi magnit aralashtirgich, aralashtirgichli	TU 25-11.834-80
NSh 29, KnKSh 250-29/32 tipidagi tekis taglikli konussimon 250 sm 3 kolbalar	GOST 10394-74
To'q rangli shishadan yasalgan vidalanadigan shisha butilkalar (yomon), hajmi 7 sm 3
O'lchov kolbalari, sig'imi 100, 500, 1000 sm 3 turdagi 2-100-2,2-500-2
Laboratoriya voronkalari
Nok shaklidagi kolbalar 10 sm 3 NSh 14,5, GrKSh-10-14/23 tipidagi	GOST 10394-72

4.3. Reaktivlar va materiallar

Natriy fosfat, bir o'rnini bosuvchi, 2-suv, analitik nav
Natriy xlorid, reaktiv darajasi
Asetonitril, maxsus tozalik darajasi, 0 daraja
Metanol, maxsus tozaligi
Fosfor kislotasi, maxsus tozaligi	TU 2612-014-00203677-97
Muzlik sirka kislotasi, reaktiv darajasi
Toluol, analitik daraja
Immunoaffinite ustunlari Ochraprep (R-Biopharm, Buyuk Britaniya)

. O'lchovlarni olishga tayyorgarlik

5.1. Okratoksin A ning standart eritmalarini tayyorlash

Standart saqlash eritmasini (oxratoksin A konsentratsiyasi - 10 ng/mkl) tayyorlash uchun 5 mg kristalli oxratoksin A namunasi 500 sm 3 hajmli o‘lchov kolbasiga, 50 sm 3 toluol-sirka kislotasi aralashmasiga (98:2%) solinadi. vol.) qo'shiladi, modda to'liq eriguncha yaxshilab aralashtiriladi va bir xil erituvchilar aralashmasi bilan belgigacha suyultiriladi. Saqlash eritmasining aniq konsentratsiyasini aniqlash uchun uning optik zichligi 333 nm (D 333) to'lqin uzunligida o'lchanadi. Eritmaning konsentratsiyasi quyidagi formula bo'yicha hisoblanadi:

Keyinchalik, konsentratsiyasi 10 ng/ml bo'lgan oxratoksin A ning 5 sm 3 standart eritmasi toluol-sirka kislotasi (98: 2% hajm) aralashmasi bilan 100 sm 3 hajmgacha suyultiriladi va ishchi eritma olinadi. 0,5 ng/ml konsentratsiyasi bilan.

Okratoksin A ning 0,005 konsentratsiyali ishchi eritmalarini tayyorlash; 0,05 va 0,1 ng/ml dan mos ravishda 50, 500 va 1000 mkl konsentratsiyasi 0,5 ng/ml bo‘lgan eritmadan olib, quruq bo‘lguncha bug‘lanadi va harakatlanuvchi fazaning 5 sm 3 qismida eritiladi.

Okratoksin A saqlash eritmasi bir yilgacha qorong'i, salqin joyda (taxminan 0 ° C haroratda) maydalangan tiqinli shisha idishda saqlanadi va ishchi standart eritmalarni tayyorlash uchun ishlatiladi. Ishlaydigan standart eritmalar qorong'i shisha flakonlarda 1 oy davomida qorong'i va salqin joyda (taxminan 0 ° C haroratda) saqlanadi.

Ishlaydigan standart echimlarni ishlatishdan oldin ularni xona haroratiga etkazish kerak va shundan keyingina qopqoqlarni ochish kerak.

5.2. Fosfat bufer eritmasini tayyorlash, pH = 7,4

Og'irligi 1,15 g bo'lgan natriy fosfat 12-suv namunasi, og'irligi 0,124 g bo'lgan natriy mono o'rnini bosuvchi 2-suv va og'irligi 1,74 g natriy xlorid namunasi sig'imi 101 sm bo'lgan o'lchov kolbasiga o'tkaziladi, unga - 03 qo'shing. 20 sm 3 distillangan suv. Aralashtiring va kolbadagi eritma hajmini belgiga moslang. Yaroqlilik muddati: muzlatgichda 1 oy.

5.3. Erituvchi aralashmalarni tayyorlash

Toluol-sirka kislota (98:2 % haqida.).

1000 sm 3 hajmli o'lchov kolbasiga 20 sm 3 sirka kislota qo'shing va aralashtirib, toluol bilan belgiga sozlang. Yaroqlilik muddati: salqin, qorong'i joyda 1 oy.

Asetonitril-suv (60:40 % haqida.).

1000 sm 3 hajmli o'lchov kolbasiga 600 sm 3 atsetonitril qo'shing va aralashtirib, suv bilan belgiga keltiring. Yaroqlilik muddati: salqin, qorong'i joyda 1 oy.

Asetonitril-suv (60:40 % haqida.; pH = 3 ,0 ).

1000 sm 3 hajmli o'lchov kolbasiga 600 sm 3 atsetonitril qo'shing va aralashtirib, ikki marta distillangan suv bilan belgiga keltiring. Fosfor kislotasini qo'shib, aralashmaning pH qiymati 3,0 qiymatiga o'rnatiladi. Yaroqlilik muddati: salqin, qorong'i joyda 1 oy.

Metanol-sirka kislota (98:2 % haqida.).

1000 sm 3 hajmli o'lchov kolbasiga 20 sm 3 sirka kislota qo'shing va aralashtirib, metanol bilan belgiga keltiring. Yaroqlilik muddati: salqin, qorong'i joyda 1 oy.

. Tahlil uchun namunalarni tanlash va tayyorlash

6.1. Namuna olish

Muayyan turdagi mahsulotlardan namuna olishning o'ziga xos xususiyatlarini hisobga olish uchun amaldagi me'yoriy-texnik hujjatlarga amal qilish kerak:

"Makkajo'xori. Qabul qilish qoidalari va namuna olish usullari" GOST 13586.3-83;

“Yormalar. Qabul qilish qoidalari va namuna olish usullari" GOST 26312.1-84;

“Un va kepak. Qabul qilish va namuna olish usullari" GOST 27668-88;

“Konservalangan oziq-ovqat mahsulotlari. Namuna olish va ularni sinovga tayyorlash" GOST 8756.0-70.

Butun lot uchun mikotoksin kontsentratsiyasini ifodalovchi tahlil uchun namunalar 2 kg og'irlikdagi oldindan gomogenlashtirilgan o'rtacha (dastlabki) namunadan olinishi kerak.

6.2. Namunalarni tahlil qilish uchun tayyorlash

Tanlangan namunalar laboratoriya tegirmonida 1-2 daqiqa davomida maydalanadi. Bunday holda, ikkita parallel namunalar qo'llaniladi.

6.2.1. Ekstraksiya

25 g hajmli maydalangan namuna namunasi 250 sm, tubi tekis bo‘lgan konussimon kolbaga solinadi va unga 100 sm 3 asetonitril-suv aralashmasi (60:40 % hajm) qo‘shiladi. 30 daqiqa davomida namunali silkitgich yordamida ekstrakti. Olingan aralash ko'k lenta katlanmış qog'oz filtri orqali filtrlanadi. 10 sm 3 filtrat olinadi va 90 sm fosfat bufer eritmasi, pH = 7,4 qo'shiladi.

6.2.2. Ekstraktni tozalash

Olingan aralashmaning 100 ml immunoaffinite ustuniga sekundiga 1 - 2 tomchi tezlikda qo'llaniladi, 20 sm 3 fosfat bufer eritmasi bilan yuviladi, pH = 7,4. Oxratoksin A 3 sm 3 metanol-sirka kislotasi aralashmasi (98: 2% hajm) bilan suziladi.

. O'lchovlarni olish

7.1. Sinov namunasini tayyorlash

Eluat quruq bo'lgunga qadar bug'lanadi. Quruq qoldiq 400 mkl mobil fazada (A eritmasi) eritiladi.

7.2. Xromatografiya shartlari

HPLC shartlari: mobil faza - asetonitril-suv (60:40% hajm; pH = 3,0); mobil faza tezligi - 1,5 sm 3 / min.

Ftorimetrik detektor 333 nm hayajonli radiatsiya to'lqin uzunligiga o'rnatiladi va emissiya chizig'ida 466 nm o'tish diapazoni bo'lgan emissiya filtri o'rnatiladi.

Namunalarni tahlil qilish uchun mikroshprits yordamida xromatograf injektoriga 50 mkl sinov namunasi (A eritmasi) yuboriladi. Agar oxratoksin A bilan ushlab turish vaqtida eng yuqori nuqta bo'lsa, in'ektsiyadagi oxratoksin A ning massasi kalibrlash grafigi yordamida hisoblanadi.

. O'lchov natijalarini qayta ishlash

8.1. Darajali munosabatlarni qurish

Kalibrlash egri chizig'ini qurish uchun standartlarning bir qator ishchi yechimlarining xromatografik tahlili o'tkaziladi. 0,005 ng/ml konsentratsiyali 50 mkl ishchi standart eritma mikroshprits yordamida injektorga yuboriladi, bu 0,25 ng okratoksin A ga to'g'ri keladi. Xuddi shu narsa 0,05 va 0,10 ng/ml konsentratsiyali boshqa standart eritmalar uchun ham bajariladi. , bu o'z navbatida inyeksiyada 2,5 va 5,0 ng oxratoksin A ga to'g'ri keladi. Bunday sharoitda oxratoksin A ni ushlab turish vaqti 4 dan 5 minutgacha. Olingan ma'lumotlarga asoslanib, kalibrlash grafigi tuziladi (xromatografik tepalik maydonining in'ektsiyadagi oxratoksin A massasiga bog'liqligi).

8.2. Natijalarni ro'yxatdan o'tkazish

Namunadagi okratoksin A ning kontsentratsiyasi quyidagi formula bo'yicha hisoblanadi:

C (qo'riqchi A)- namunadagi oxratoksin A konsentratsiyasi, mg/kg;

M- tahlil uchun namuna massasi, g (25,0);

T- xromatografga kiritilgan A eritmasi hajmiga mos keladigan oxratoksin A massasi, ng;

V 1 - ekstraksiya uchun eritma hajmi, sm 3 (100);

D - mutlaq xato chegarasi:

d - usulning nisbiy xatosi chegarasi (aniqlik ko'rsatkichi), % (1-jadval).

Agar namunadagi okratoksin A ning miqdori belgilangan kontsentratsiyalar diapazonining pastki chegarasidan kam bo'lsa, tahlil natijasi quyidagicha ko'rsatiladi:

* 0,0001 mg/kg - aniqlash chegarasi.

8.3. Parallel aniqlash natijalarining maqbulligini tekshirish

Parallel o'lchovlar orasidagi ruxsat etilgan tafovut (R) takrorlanish chegarasi asosida aniqlanadi (r) (1-jadval):

R = 0,01 (r, %) × , mg/kg

Agar parallel ta'riflar orasidagi tafovut ruxsat etilgan chegaradan oshmasa:

keyin tahlil natijasi sifatida o'rtacha arifmetik qiymat olinadi.

Agar standart oshib ketgan bo'lsaRo'lchovlarni zaxira namunalar yordamida takrorlash kerak.

. O'lchov natijalari sifatini nazorat qilish

O'lchov xatosini monitoring qilish chastotasi nazorat qilinadigan davrdagi operatsion o'lchovlar soniga bog'liq va nazorat rejalari bilan belgilanadi.

Nazorat namunalari oziq-ovqat xom ashyosi va oziq-ovqat mahsulotlarining ishchi namunalari hisoblanadi. Namuna oling va uni ikkita teng qismga bo'ling. Ulardan biri o'zgarishsiz qoldiriladi, ikkinchisiga esa shunday miqdorda oxratoksin A standart eritmasi qo'shiladiki, uning namunadagi massa ulushi dastlabki qiymatga nisbatan 50 - 100% ga oshadi. Qo'shimchani namunani tayyorlash boshlanishidan oldin namunaga kiritish kerak.

Ikkala namuna ham metodologiya ko'rsatmalariga qat'iy muvofiq tahlil qilinadi va asl namunaning tahlili natijalari olinadi ( C (neg. A)) va qo'shimchali namunalar ( BILAN ¢ (narsa A)). Aniqlash bir xil sharoitlarda amalga oshiriladi, ya'ni: tahlil bitta tahlilchi tomonidan bitta hajmli shisha idishlar, reagentlar, eritmalar va boshqalar yordamida amalga oshiriladi.

Qo'shimchalar usulidan foydalangan holda operatsion xatolarni nazorat qilish algoritmi namunani qo'shimcha bilan nazorat qilish o'lchovi natijasi o'rtasidagi farqga teng bo'lgan nazoratni aniqlash natijasini solishtirishdan iborat ( BILAN ¢ (oxra)), qo'shimchalarsiz namunalar ( C (qo'riqchi A)) va qo'shimchalar miqdori ( Ex (qo'riqchi A) bilan) operatsion nazorat standartlari bilan (K). Qoniqarli xato to'g'risidagi qaror quyidagi shart bajarilganda qabul qilinadi (agar R va

Atrof-muhit harorati 15 dan 25 ° C gacha.

25 ° C da nisbiy havo namligi 80% dan oshmaydi.

Atmosfera bosimi 730 - 760 mm Hg.

Quvvat manbai kuchlanishi: 210 - 220 V. AC chastotasi: 45 - 50 Hz.