Grzyby wytwarzające ochratoksyny to grzyby z rodzajów Aspergillus i Penicillium. Pierwsze doniesienia na temat toksyczności produktów przemiany materii grzyba A. ochraceus dla kaczek sporządził Scott w 1965 roku. W kolejnych latach przeprowadzono dużą liczbę badań mających na celu wyizolowanie produktów przemiany materii tego grzyba w czystej postaci, rozszyfrowanie budowa chemiczna izolowanych mikotoksyn, badanie ich aktywności biologicznej, warunki powstawania toksyn, metody oznaczania w różnych substratach biologicznych. Nazwa ochratoksyny wzięła się od rodzaju grzyba, który był pierwszym producentem tej mikotoksyny.

Z hodowli grzyba A. ochraceus wyizolowano cztery ochratoksyny – A, B, C i D. Największe znaczenie sanitarne i toksykologiczne ma ochratoksyna A. Dobrze rozpuszcza się w acetonie, benzenie, acetonitrylu, chloroformie i alkoholach. Podczas interakcji z chlorkiem żelaza tworzy czerwony kompleks i silne kompleksy z zasadami.

Głównymi grzybami wytwarzającymi ochratoksyny są A. ochraceus i P. veridicatum. W krajach o klimacie ciepłym pasza jest najczęściej zanieczyszczona ochratoksyną z grzyba A. ochraceus, w krajach o klimacie umiarkowanym – z grzyba P. veridicatum. Optymalna temperatura podłoża, w której podczas uprawy następuje największe powstawanie toksyn, wynosi 28°C dla grzybów A. ochraceus i 20°C dla grzybów P. veridicatum.

Według N.V. Volkova (1980) z 316 izolatów grzybów wyizolowanych w pięciu kompleksach hodowli trzody chlewnej na Ukrainie, 106 szczepów (33,5%) zostało sklasyfikowanych jako grzyby A. ochraceus. Z tej ilości cztery izolaty wytworzyły ochratoksynę A.

Grzyby – producenci ochratoksyny A – często występują w paszach w Rosji, ale odnotowano bardzo niewiele przypadków chorób zwierząt. Wynika to z braku czułej i swoistej metody oznaczania ochratoksyny A w paszach. Ostatnio ochratoksykozę A zidentyfikowano w wielu fermach trzody chlewnej w rejonie Kurska i Biełgorodu (G. P. Kononenko i in., 1999).

Ochratoksyny, podobnie jak inne mikotoksyny, ulegają stosunkowo szybkiemu zniszczeniu w organizmie zwierząt. Istnieją jednak doniesienia, że ​​w zależności od dawki mikotoksyna może pozostawać w tkance mięśniowej i mięśniach świń do 2 tygodni, w wątrobie do 3 tygodni, a w nerkach do 4 tygodni. Dlatego też należy wyznaczyć termin uboju zwierząt po ostatnim przypadku przedostania się mikotoksyn do organizmu na 4 tygodnie. Możliwe jest również, że mikotoksyny przedostają się do mleka, jeśli są spożywane w stosunkowo dużych ilościach z paszą.

Ochratoksyna A odnosi się do wysoce toksycznych związków - LD5o dla zwierząt laboratoryjnych przy jednorazowym podaniu doustnym w dawce 20-28 mg/kg masy zwierzęcia, dla kurcząt 7-dniowych 11-15 mt/kg. Mikotoksyny wykazują wyraźną akumulację. Najbardziej wrażliwe są na to świnie, zwłaszcza młode, a następnie ptaki.

Gdy zawartość mikotoksyn w paszy wynosiła 0,2-0,4 mg/kg paszy, świnie, nawet przy długotrwałym karmieniu, nie wykazywały klinicznych objawów zatrucia, natomiast obserwowano zmniejszenie przyrostów masy ciała zwierząt i wielomocz. Dla kurcząt dawka subtoksyczna wynosi 0,6-0,8 mg/kg paszy, dawka toksyczna wynosi 1,5-2,0 mg/kg. Gdy zawartość ochratoksyny A w paszy wzrosła do 5 mg/kg, u świń i kurcząt widoczne były objawy zatrucia i śmierci poszczególnych zwierząt.

Toksykodynamika. Niewystarczająco jasne. Ochratoksyna A atakuje przede wszystkim nerki, dlatego w Danii, gdzie po raz pierwszy odnotowano tę mikotoksykozę u świń, nazwano ją „nefropatią mikotoksyczną świń”. Ustalono, że ochratoksyny dostając się do krwi, stosunkowo szybko wiążą się z jej białkami. Być może, wchodząc do kwaśnego środowiska nerek, mikotoksyna zostaje uwolniona i wykazuje działanie nefropatyczne.

Klinika. Przewlekła ochratoksykoza, która w warunkach praktycznych występuje częściej, objawia się bardzo słabo. U zwierząt wzrasta pragnienie, wyraża się wielomocz i zmniejsza się przyrost masy ciała. W niektórych przypadkach we krwi obserwuje się leukocytozę, wzrost liczby limfocytów i zmniejszenie liczby bazofilów. U kurcząt obserwuje się ogólną depresję, potargane pióra i zmniejszoną produktywność. Według niektórych autorów na skorupkach jaj pojawiają się żółte plamy.

Leczenie. Nie ma konkretnych metod leczenia. Przede wszystkim należy wykluczyć z diety paszę zawierającą ochratoksynę A lub zanieczyszczoną pleśnią. Skuteczne jest wprowadzanie do paszy różnych adsorbentów, takich jak zeolity, glaukonity itp.

Zmiany patologiczne. Najczęstszym objawem ochratoksykozy jest uszkodzenie nerek. Z reguły są powiększone, torebka jest w niektórych miejscach połączona z korą. Na przekroju kora jest blada; pod torebką mogą znajdować się cysty o wielkości 1 – 2 mm. Badanie histologiczne ujawnia martwicę komórek kanalików proksymalnych, proliferację tkanki łącznej w warstwie korowej.

Czasami w jamie brzusznej stwierdza się zwiększoną zawartość płynu. W niektórych przypadkach wątroba jest powiększona, a jej komórki ulegają martwicy.

Badanie weterynaryjne. W przypadku przymusowego uboju zwierząt w przypadku ochratoksykozy należy zbadać narządy i tkanki, a zwłaszcza nerki, na obecność mikotoksyn. Nie ustalono NDP ochratoksyny w mięsie i podrobach. W przypadku wykrycia pozostałości mykotoksyn tuszę i narządy wewnętrzne poddaje się utylizacji.

Ulotka

Zestawy są systemami testowymi do testów immunologicznych enzymatycznych. Produkowane są masowo zgodnie z normą ISO 9000 wraz z niezbędnymi odczynnikami i przeznaczone są do ilościowego oznaczania ochratoksyny w zbożach, paszach, produktach zbożowych, piwie i surowicy krwi. Wytyczne dotyczące stosowania systemów testowych RIDASCREEN ® FAST Ochratoksyna A I RIDASCREEN ® Ochratoksyna A zatwierdzony przez Dyrekcję Weterynaryjną Federalnej Agencji Rolnictwa Ministerstwa Rolnictwa Rosji pod numerem MUK 5-1-14/1001. Systemy znajdują się w „Wykazie dokumentacji regulacyjnej dopuszczonej do stosowania w państwowych laboratoriach weterynaryjnych do diagnostyki chorób zwierząt, ryb, pszczół oraz monitorowania bezpieczeństwa surowców pochodzenia zwierzęcego i roślinnego”. Systemy testowe RIDASCREEN ® FAST Ochratoksyna A odpowiadać GOST 34108-2017„Pasze, mieszanki paszowe, surowce paszowe. Oznaczanie zawartości mikotoksyn metodą bezpośredniego testu immunologicznego kompetycyjnego w fazie stałej.”

Oznaczanie ochratoksyny A w zbożach, paszach, produktach zbożowych, piwie i surowicy krwi

Ochratoksyna jest substancją toksyczną powstającą w wyniku działania grzybów pleśniowych z rodzaju Aspergillus I Penicillium. Oprócz ciężkiej nefrotoksyczności ochratoksyna ma właściwości hepatotoksyczne, teratogenne, rakotwórcze i immunosupresyjne. Ochratoksyna może przedostać się do organizmu człowieka wraz z produktami pochodzenia roślinnego i zwierzęcego. Występuje nie tylko w zbożach (13% pozytywnych próbek) i paszach dla zwierząt, ale także we krwi świń (60% pozytywnych próbek) i nerkach (21% pozytywnych próbek).

Regulamin Techniczny Unii Celnej TR CU 021/2011 „W sprawie bezpieczeństwa produktów spożywczych” regulują następujący maksymalny poziom zawartości ochratoksyny A: w zbożach spożywczych, zbożach, mące – 0,005 mg/kg (5 μg/kg); w żywności dla niemowląt, produktach spożywczych dla przedszkolaków i uczniów, produktach spożywczych dla kobiet w ciąży i karmiących piersią – niedozwolone (<0,0005 мг/кг).

Projekt ustawy federalnej № 349084-5 „Przepisy techniczne dotyczące wyrobów winiarskich” określają wymagania dotyczące zawartości ochratoksyny A w winie nieprzekraczającej 0,002 mg/l.

Projekt ustawy federalnej „W sprawie wymagań dotyczących bezpieczeństwa produktów spożywczych oraz procesów ich produkcji, przechowywania, transportu, sprzedaży i usuwania” zawiera również wymóg obowiązkowej kontroli ziaren spożywczych pod kątem ochratoksyny A, której zawartość nie powinna przekraczać 0,005 mg/kg. Aktualne regulacje prawne można znaleźć na stronie internetowej Compact24.com.

Do niedawna do monitorowania ochratoksyny stosowano głównie metody chromatograficzne (wysokosprawna chromatografia cieczowa, chromatografia cienkowarstwowa). Znacznie wygodniejszą metodą jest test immunoenzymatyczny (ELISA lub ELISA), który charakteryzuje się bardzo wysoką czułością.

Specyfikacja:	RIDASCREEN ® FAST Ochratoksyna A	RIDASCREEN ® Ochratoksyna A 30/15
Format:	Płytka z paskami, 48 dołków (6 pasków po 8 dołków)	Płytka z paskami, 96 dołków (12 pasków po 8 dołków)
Standardy:	0 / 5 / 10 / 20 / 40 µg/l	0 / 50 / 100 / 300 / 900 / 1800 ng/l
Przygotowanie próbki:	Mielenie próbek, ekstrakcja, filtracja	ekstrakcja, wirowanie/filtracja (ziarno, pasza); ekstrakcja, wirowanie, filtracja, wytrząsanie, nadekstrakcja, wirowanie, odparowywanie (piwo/surowica krwi)
Koszty czasu:
Granica wykrywalności:	0,005 mg/kg	0,001250 mg/kg (ziarno, pasza) 0,000050 mg/kg (piwo, surowica krwi)

Powiązane produkty:

Ochratoksyny są wytwarzane przez niektóre rodzaje grzybów Aspergillus I Penicillium. Głównymi producentami są A.ochraceus I P. viridicatum. Te grzyby można znaleźć wszędzie. Aspergillus wytwarza ochratoksyny w podwyższonej temperaturze i wilgotności oraz Penicillium już o 5°С. Ochratoksyny są wysoce toksycznymi związkami o wyraźnym działaniu teratogennym.

Ochratoksyny A, B i C to grupa strukturalnie podobnych związków, które są izokumarynami związanymi z L-wiązanie peptydowe fenyloalaniny. W zależności od charakteru rodników powstają różne typy ochratoksyn (tab. 2.3.).

Ochratoksyna A jest bezbarwną substancją krystaliczną, słabo rozpuszczalną w wodzie, średnio rozpuszczalną w polarnych rozpuszczalnikach organicznych (metanol, chloroform) oraz w wodnym roztworze węglanu sodu. W czystej chemicznie postaci jest niestabilny i bardzo wrażliwy na światło i powietrze, natomiast w roztworze etanolu może pozostać niezmieniony przez długi czas. W świetle UV wykazuje zieloną fluorescencję.

Ochratoksyna B jest substancją krystaliczną, analogiem ochratoksyny A, która nie zawiera atomu chloru. Jest około 50 razy mniej toksyczna niż ochratoksyna A. W świetle UV fluoryzuje na niebiesko.

Ochratoksyna C jest substancją amorficzną, estrem etylowym ochratoksyny A, o toksyczności zbliżonej do niej, ale nie stwierdzono jej jako naturalnego zanieczyszczenia żywności i paszy. W świetle U ma bladozieloną fluorescencję.

Ochratoksyny należą do mikotoksyn toksycznych, charakteryzują się wysoką toksycznością dla wątroby, nerek, właściwościami teratogennymi i immunosupresyjnymi oraz wyraźnym działaniem hemolitycznym. Spośród ochratoksyn najbardziej toksyczna jest ochratoksyna A (LD 50 = 3,4 mg/kg, (jednodniowe pisklęta, doustnie)). Jest bardziej toksyczny niż aflatoksyny. Inne mikotoksyny z tej grupy są o rząd wielkości mniej toksyczne.

Biochemiczne, molekularne i komórkowe mechanizmy działania ochratoksyn nie zostały dostatecznie zbadane. Wiadomo, że ochratoksyna A hamuje syntezę białek i metabolizm węglowodanów, w szczególności glikonogenezę, poprzez hamowanie aktywności fenyloalaniny – t-RNA – specyficznego enzymu, który odgrywa kluczową rolę w początkowej fazie syntezy białek.

Ochratoksyna A występuje w kukurydzy, jęczmieniu, pszenicy, owsie i jęczmieniu. Ważnym i niebezpiecznym faktem jest to, że gdy zboża paszowe i pasze są silnie zanieczyszczone, w produktach pochodzenia zwierzęcego (szynka, boczek, kiełbasy) znajduje się ochratoksyna A. Ochratoksyna B jest rzadka. Ochratoksyny wpływają także na wszystkie owoce roślin ogrodniczych. Szczególnie dotknięte są jabłka: nawet 50% plonów może zostać skażone mikotoksynami.

Należy zaznaczyć, że ochratoksyny są związkami trwałymi. Na przykład przy długotrwałym ogrzewaniu pszenicy zanieczyszczonej ochratoksyną A jej zawartość spadła tylko o 32% (w temperaturze 250–300°С). Zatem występowanie w żywności, toksyczność i trwałość ochratoksyn stanowią realne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego.

Metody analizy

Ochratoksyna A występuje w utlenionej żywności. Jest łatwo rozpuszczalny w wielu rozpuszczalnikach organicznych stosowanych do ekstrakcji. Najczęściej stosowana jest ekstrakcja chloroformem i wodnym roztworem kwasu fosforowego, a następnie oczyszczanie na kolumnie i oznaczanie ilościowe metodą TLC.

Opracowano także metodę HPLC. Przed analizą HPLC próbkę przygotowuje się w następujący sposób. Rozdrobnioną próbkę traktuje się mieszaniną 2 M kwasu solnego i 0,4 M roztworu chlorku magnezu. Po homogenizacji ekstrahować toluenem przez 60 minut. Mieszaninę odwirowuje się. Wirówkę przepuszcza się przez kolumnę z żelem krzemionkowym i przemywa mieszaniną toluenu i acetonu (faza ruchoma). Ochratoksynę A eluuje się mieszaniną toluenu i kwasu octowego (9:1) i suszy w temperaturze 40°C. Pozostałość rozpuszcza się i filtruje. Analizę przeprowadza się za pomocą HPLC.

Ponadto opracowano szereg testów biologicznych na krewetkach i bakteriach, jednak uzyskane wyniki nie pozwoliły na zastosowanie tych metod do oznaczania ochratoksyn.



Stężenie ochratoksyny A w próbce, mg/kg

Granice błędu względnego (wskaźnik dokładności) (±d), %, R = 0,95

Odchylenie standardowe powtarzalności (s R), %

Granica powtarzalności ( R), %

Kompletność ekstrakcji substancji,%

4.2. Sprzęt pomocniczy

Urządzenie do wytrząsania próbek typu AVU-6S lub podobne
Wyparka rotacyjna IR-1M z syfonem lub podobnym
Elektryczna suszarnia laboratoryjna z błędem utrzymania temperatury ±2,5 w zakresie od 50 do 350°C
Lodówka domowa
Elektryczny młynek laboratoryjny EM-3A lub podobny miernik pH	TU 46-22-236-79
Mieszadło magnetyczne typu MM 5 z mieszadłem	TU 25-11.834-80
Kolby stożkowe płaskodenne 250 cm3 z NSh 29, typ KnKSh 250-29/32	GOST 10394-74
Butelki szklane zakręcane, wykonane z ciemnego szkła (podłe), pojemność 7 cm3
Kolby miarowe o pojemności 100, 500, 1000 cm3 typ 2-100-2,2-500-2
Lejki laboratoryjne
Kolby gruszkowe 10 cm3 z NSh 14,5, typ GrKSh-10-14/23	GOST 10394-72

4.3. Odczynniki i materiały

. Przygotowanie do pomiarów

5.1. Przygotowanie roztworów wzorcowych ochratoksyny A

Aby przygotować standardowy roztwór do przechowywania (stężenie ochratoksyny A wynosi 10 ng/μl), próbkę 5 mg krystalicznej ochratoksyny A umieszcza się w kolbie miarowej o pojemności 500 cm3, 50 cm3 mieszaniny toluenu i kwasu octowego (98:2% obj. ), dokładnie miesza się aż do całkowitego rozpuszczenia substancji i doprowadza tę samą mieszaninę rozpuszczalników do kreski. Aby ustalić dokładne stężenie roztworu do przechowywania, mierzy się jego gęstość optyczną przy długości fali 333 nm (D333). Stężenie roztworu oblicza się ze wzoru:

Aby przygotować roztwory robocze ochratoksyny A o stężeniu 0,005; 0,05 i 0,1 ng/μl, pobrać odpowiednio 50, 500 i 1000 μl roztworu o stężeniu 0,5 ng/μl, odparować do sucha i rozpuścić w 5 cm3 fazy ruchomej.

Roztwór do przechowywania ochratoksyny A przechowuje się w szklanym pojemniku z wbitym korkiem w ciemnym, chłodnym miejscu (w temperaturze około 0°C) przez okres do jednego roku i wykorzystuje się go do przygotowania roboczych roztworów wzorcowych. Robocze roztwory wzorcowe przechowuje się w fiolkach z ciemnego szkła w chłodnym, ciemnym miejscu (w temperaturze około 0°C) przez 1 miesiąc.

Przed użyciem roztworów wzorcowych należy je doprowadzić do temperatury pokojowej i dopiero wtedy otworzyć zakrętki.

5.2. Przygotowanie roztworu buforu fosforanowego o pH = 7,4

Próbkę dipodstawionej 12-wody fosforanem sodu o masie 1,15 g, próbkę monopodstawionej 2-wody sodu o masie 0,124 g i próbkę chlorku sodu o masie 1,74 g przenosi się do kolby miarowej o pojemności 100 cm3, dodaje 10 - 20 cm3 wody destylowanej. Mieszać i dopasowywać objętość roztworu w kolbie do kreski. Okres ważności: 1 miesiąc w lodówce.

5.3. Przygotowanie mieszanin rozpuszczalników

Toluen-ocet kwas (98:2 % o.).

Do kolby miarowej o pojemności 1000 cm3 dodać 20 cm3 kwasu octowego i mieszając uzupełnić toluenem do kreski. Okres przydatności do spożycia: 1 miesiąc w chłodnym, ciemnym miejscu.

Acetonitryl-woda (60:40 % o.).

Do kolby miarowej o pojemności 1000 cm3 dodać 600 cm3 acetonitrylu i mieszając dodać wodę do kreski. Okres przydatności do spożycia: 1 miesiąc w chłodnym, ciemnym miejscu.

Acetonitryl-woda (60:40 % o.; pH = 3 ,0 ).

Do kolby miarowej o pojemności 1000 cm3 dodać 600 cm3 acetonitrylu i mieszając doprowadzić do kreski wodą podwójnie destylowaną. Dodając kwas fosforowy, pH mieszaniny doprowadza się do wartości 3,0. Okres przydatności do spożycia: 1 miesiąc w chłodnym, ciemnym miejscu.

Metanol-ocet kwas (98:2 % o.).

Do kolby miarowej o pojemności 1000 cm3 dodać 20 cm3 kwasu octowego i mieszając doprowadzić do kreski metanolem. Okres przydatności do spożycia: 1 miesiąc w chłodnym, ciemnym miejscu.

. Wybór i przygotowanie próbek do analizy

6.1. Próbowanie

Aby wziąć pod uwagę specyfikę pobierania próbek niektórych rodzajów produktów, należy kierować się aktualną dokumentacją regulacyjną i techniczną:

"Kukurydza. Zasady akceptacji i metody pobierania próbek” GOST 13586.3-83;

"Kasza. Zasady akceptacji i metody pobierania próbek” GOST 26312.1-84;

„Mąka i otręby. Metody akceptacji i pobierania próbek” GOST 27668-88;

„Produkty spożywcze w puszkach. Pobieranie próbek i przygotowanie ich do badania” GOST 8756.0-70.

Próbki do analizy, reprezentatywne dla stężenia mikotoksyn dla całej partii, należy pobrać z wstępnie homogenizowanej próbki średniej (początkowej) o masie 2 kg.

6.2. Przygotowanie próbek do analizy

Wybrane próbki rozdrabnia się przez 1 – 2 minuty w młynku laboratoryjnym. W tym przypadku stosuje się dwie równoległe próbki.

6.2.1. Ekstrakcja

Próbkę rozdrobnionej próbki o masie 25 g umieszcza się w płaskodennej kolbie stożkowej o średnicy 250 cm i dodaje 100 cm3 mieszaniny acetonitryl-woda (60:40% obj.). Ekstrahować za pomocą wytrząsarki do próbek przez 30 minut. Powstałą mieszaninę przesącza się przez złożony z niebieskiej wstążki papierowy filtr. Pobrać 10 cm3 przesączu i dodać 90 cm roztworu buforu fosforanowego o pH = 7,4.

6.2.2. Oczyszczanie ekstraktu

100 ml powstałej mieszaniny nanosi się na kolumnę powinowactwa immunologicznego z szybkością 1 - 2 kropli na sekundę, przemywa 20 cm3 roztworu buforu fosforanowego o pH = 7,4. Ochratoksynę A eluuje się 3 cm3 mieszaniny metanol-kwas octowy (98:2% obj.).

. Wykonywanie pomiarów

7.1. Przygotowanie próbki do badania

Eluat odparowuje się do sucha. Suchą pozostałość rozpuszcza się w 400 µl fazy ruchomej (roztwór A).

7.2. Warunki chromatografii

Warunki HPLC: faza ruchoma – acetonitryl-woda (60:40% obj.; pH = 3,0); prędkość fazy ruchomej - 1,5 cm3/min.

Detektor fluorymetryczny jest ustawiony na długość fali promieniowania ekscytującego 333 nm, a na linii emisyjnej zainstalowany jest filtr emisyjny o pasmie przepustowym 466 nm.

Aby przeprowadzić analizę próbek, za pomocą mikrostrzykawki wstrzykuje się 50 µl próbki testowej (roztwór A) do iniektora chromatografu. Jeżeli występuje pik pokrywający się z czasem retencji ochratoksyny A, masę ochratoksyny A we wstrzyknięciu oblicza się za pomocą wykresu kalibracyjnego.

. Przetwarzanie wyników pomiarów

8.1. Budowa stopniowanej relacji

Aby skonstruować krzywą kalibracyjną, przeprowadza się analizę chromatograficzną szeregu roztworów roboczych wzorców. Do wtryskiwacza za pomocą mikrostrzykawki wstrzykuje się 50 µl roboczego roztworu wzorcowego o stężeniu 0,005 ng/µl, co odpowiada 0,25 ng ochratoksyny A. Podobnie postępujemy z innymi roztworami wzorcowymi o stężeniach 0,05 i 0,10 ng/µl , co z kolei odpowiada 2,5 i 5,0 ng ochratoksyny A w zastrzyku. W tych warunkach czas retencji ochratoksyny A mieści się w zakresie od 4 do 5 minut. Na podstawie uzyskanych danych konstruuje się wykres kalibracyjny (zależność powierzchni piku chromatograficznego od masy ochratoksyny A we wstrzyknięciu).

Wynik analizy prezentowany jest w postaci (z prawdopodobieństwem R = 0,95):

D - bezwzględna granica błędu:

d jest granicą błędu względnego techniki (wskaźnik dokładności),% (Tabela 1).

* 0,0001 mg/kg to granica wykrywalności.

. Wymagania dotyczące kwalifikacji wykonawcy

Do wykonywania analiz ochratoksyny A w ziarnie i produktach zbożowych dopuszczane są osoby posiadające wykształcenie wyższe specjalne lub średnie specjalistyczne, posiadające biegłą wiedzę w zakresie technik analizy HPLC, które przeszły odpowiednie przeszkolenie oraz doświadczenie w pracy w laboratorium chemicznym.

. Warunki pomiaru

Temperatura otoczenia od 15 do 25°C.

Wilgotność względna powietrza nie większa niż 80% przy 25°C.

Ciśnienie atmosferyczne 730 - 760 mm Hg.

Napięcie zasilania: 210 - 220 V. Częstotliwość prądu przemiennego: 45 - 50 Hz.

Stężenie ochratoksyny A w próbce, mg/kg

Granice błędu względnego (wskaźnik dokładności) (±d), %, R = 0,95

Odchylenie standardowe powtarzalności (s R), %

Granica powtarzalności ( R), %

Kompletność ekstrakcji substancji,%

4. Przyrządy pomiarowe, urządzenia pomocnicze, wyroby szklane, odczynniki i materiały

4.1. Przyrządy pomiarowe

4.2. Sprzęt pomocniczy

Urządzenie do wytrząsania próbek typu AVU-6S lub podobne	TU 64-1-2451
Wyparka rotacyjna IR-1M z syfonem lub podobnym	TU 25-11917
Elektryczna suszarnia laboratoryjna z błędem utrzymania temperatury ±2,5 w zakresie od 50 do 350°C	TU 16-531.639
Lodówka domowa
Elektryczny młynek laboratoryjny EM-3A lub podobny miernik pH	TU 46-22-236-79
Mieszadło magnetyczne typu MM 5 z mieszadłem	TU 25-11.834-80
Kolby płaskodenne stożkowe 250 cm 3 z NSh 29, typ KnKSh 250-29/32	GOST 10394-74
Butelki szklane zakręcane z ciemnego szkła (podłe) o pojemności 7 cm 3
Kolby miarowe o pojemności 100, 500, 1000 cm 3 typ 2-100-2,2-500-2
Lejki laboratoryjne
Kolby gruszkowe 10 cm 3 z NSh 14,5, typ GrKSh-10-14/23	GOST 10394-72

4.3. Odczynniki i materiały

Fosforan sodu, monopodstawiony, 2-woda, czystość analityczna
Chlorek sodu, klasa odczynnikowa
Acetonitryl, specjalny stopień czystości, stopień 0
Metanol, specjalna czystość
Kwas fosforowy, specjalna czystość	TU 2612-014-00203677-97
Lodowaty kwas octowy, klasa odczynnika
Toluen, stopień analityczny
Kolumny powinowactwa immunologicznego Ochraprep (R-Biopharm, Wielka Brytania)

. Przygotowanie do pomiarów

5.1. Przygotowanie roztworów wzorcowych ochratoksyny A

Aby przygotować standardowy roztwór do przechowywania (stężenie ochratoksyny A - 10 ng/μl), w kolbie miarowej o pojemności 500 cm3 umieszcza się 5 mg próbkę krystalicznej ochratoksyny A, w której umieszcza się 50 cm3 mieszaniny toluenu i kwasu octowego (98:2%). obj.), ostrożnie mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia substancji i rozcieńczyć tą samą mieszaniną rozpuszczalników do kreski. Aby ustalić dokładne stężenie roztworu do przechowywania, mierzy się jego gęstość optyczną przy długości fali 333 nm (D 333). Stężenie roztworu oblicza się ze wzoru:

Następnie 5 cm 3 mianowanego roztworu ochratoksyny A o stężeniu 10 ng/μl rozcieńcza się mieszaniną kwasu toluenowo-octowego (98:2% obj.) do objętości 100 cm 3, otrzymując roztwór roboczy o stężeniu 0,5 ng/μl.

Aby przygotować roztwory robocze ochratoksyny A o stężeniu 0,005; 0,05 i 0,1 ng/μl, pobrać odpowiednio 50, 500 i 1000 μl roztworu o stężeniu 0,5 ng/μl, odparować do sucha i rozpuścić w 5 cm3 fazy ruchomej.

Roztwór do przechowywania ochratoksyny A przechowuje się w szklanym pojemniku z wbitym korkiem w ciemnym, chłodnym miejscu (w temperaturze około 0°C) przez okres do jednego roku i wykorzystuje się go do przygotowania roboczych roztworów wzorcowych. Robocze roztwory wzorcowe przechowuje się w fiolkach z ciemnego szkła w chłodnym, ciemnym miejscu (w temperaturze około 0°C) przez 1 miesiąc.

Przed użyciem roztworów wzorcowych należy je doprowadzić do temperatury pokojowej i dopiero wtedy otworzyć zakrętki.

5.2. Przygotowanie roztworu buforu fosforanowego o pH = 7,4

Próbkę dipodstawionej 12-wody fosforanem sodu o masie 1,15 g, próbkę monopodstawionej 2-wody sodu o masie 0,124 g i próbkę chlorku sodu o masie 1,74 g przenosi się do kolby miarowej o pojemności 100 cm 3, dodaje 10 - 20 cm 3 wody destylowanej. Mieszać i dopasowywać objętość roztworu w kolbie do kreski. Okres ważności: 1 miesiąc w lodówce.

5.3. Przygotowanie mieszanin rozpuszczalników

Toluen-ocet kwas (98:2 % o.).

Do kolby miarowej o pojemności 1000 cm3 dodać 20 cm3 kwasu octowego i, mieszając, uzupełnić toluenem do kreski. Okres przydatności do spożycia: 1 miesiąc w chłodnym, ciemnym miejscu.

Acetonitryl-woda (60:40 % o.).

Do kolby miarowej o pojemności 1000 cm3 dodać 600 cm3 acetonitrylu i mieszając doprowadzić wodą do kreski. Okres przydatności do spożycia: 1 miesiąc w chłodnym, ciemnym miejscu.

Acetonitryl-woda (60:40 % o.; pH = 3 ,0 ).

Do kolby miarowej o pojemności 1000 cm3 dodać 600 cm3 acetonitrylu i mieszając doprowadzić do kreski wodą podwójnie destylowaną. Dodając kwas fosforowy, pH mieszaniny doprowadza się do wartości 3,0. Okres przydatności do spożycia: 1 miesiąc w chłodnym, ciemnym miejscu.

Metanol-ocet kwas (98:2 % o.).

Do kolby miarowej o pojemności 1000 cm3 dodać 20 cm3 kwasu octowego i mieszając doprowadzić do kreski metanolem. Okres przydatności do spożycia: 1 miesiąc w chłodnym, ciemnym miejscu.

. Wybór i przygotowanie próbek do analizy

6.1. Próbowanie

Aby wziąć pod uwagę specyfikę pobierania próbek niektórych rodzajów produktów, należy kierować się aktualną dokumentacją regulacyjną i techniczną:

"Kukurydza. Zasady akceptacji i metody pobierania próbek” GOST 13586.3-83;

"Kasza. Zasady akceptacji i metody pobierania próbek” GOST 26312.1-84;

„Mąka i otręby. Metody akceptacji i pobierania próbek” GOST 27668-88;

„Produkty spożywcze w puszkach. Pobieranie próbek i przygotowanie ich do badania” GOST 8756.0-70.

Próbki do analizy, reprezentatywne dla stężenia mikotoksyn dla całej partii, należy pobrać z wstępnie homogenizowanej próbki średniej (początkowej) o masie 2 kg.

6.2. Przygotowanie próbek do analizy

Wybrane próbki rozdrabnia się przez 1 – 2 minuty w młynku laboratoryjnym. W tym przypadku stosuje się dwie równoległe próbki.

6.2.1. Ekstrakcja

Próbkę rozdrobnionej próbki o masie 25 g umieszcza się w płaskodennej kolbie stożkowej o średnicy 250 cm i dodaje 100 cm3 mieszaniny acetonitryl-woda (60:40% obj.). Ekstrahować za pomocą wytrząsarki do próbek przez 30 minut. Powstałą mieszaninę przesącza się przez złożony z niebieskiej wstążki papierowy filtr. Pobiera się 10 cm3 przesączu i dodaje 90 cm3 roztworu buforu fosforanowego o pH = 7,4.

6.2.2. Oczyszczanie ekstraktu

100 ml powstałej mieszaniny nanosi się na kolumnę powinowactwa immunologicznego z szybkością 1 - 2 kropli na sekundę, przemywa 20 cm3 roztworu buforu fosforanowego o pH = 7,4. Ochratoksynę A eluuje się 3 cm3 mieszaniny metanol-kwas octowy (98:2% obj.).

. Wykonywanie pomiarów

7.1. Przygotowanie próbki do badania

Eluat odparowuje się do sucha. Suchą pozostałość rozpuszcza się w 400 µl fazy ruchomej (roztwór A).

7.2. Warunki chromatografii

Warunki HPLC: faza ruchoma – acetonitryl-woda (60:40% obj.; pH = 3,0); prędkość fazy ruchomej - 1,5 cm 3 /min.

Detektor fluorymetryczny jest ustawiony na długość fali promieniowania ekscytującego 333 nm, a na linii emisyjnej zainstalowany jest filtr emisyjny o pasmie przepustowym 466 nm.

Aby przeprowadzić analizę próbek, za pomocą mikrostrzykawki wstrzykuje się 50 µl próbki testowej (roztwór A) do iniektora chromatografu. Jeżeli występuje pik pokrywający się z czasem retencji ochratoksyny A, masę ochratoksyny A we wstrzyknięciu oblicza się za pomocą wykresu kalibracyjnego.

. Przetwarzanie wyników pomiarów

8.1. Budowa stopniowanej relacji

Aby skonstruować krzywą kalibracyjną, przeprowadza się analizę chromatograficzną szeregu roztworów roboczych wzorców. Do wtryskiwacza za pomocą mikrostrzykawki wstrzykuje się 50 µl roboczego roztworu wzorcowego o stężeniu 0,005 ng/µl, co odpowiada 0,25 ng ochratoksyny A. Podobnie postępujemy z innymi roztworami wzorcowymi o stężeniach 0,05 i 0,10 ng/µl , co z kolei odpowiada 2,5 i 5,0 ng ochratoksyny A w zastrzyku. W tych warunkach czas retencji ochratoksyny A mieści się w zakresie od 4 do 5 minut. Na podstawie uzyskanych danych konstruuje się wykres kalibracyjny (zależność powierzchni piku chromatograficznego od masy ochratoksyny A we wstrzyknięciu).

8.2. Rejestracja wyników

Stężenie ochratoksyny A w próbce oblicza się ze wzoru:

C (strażnik A)- stężenie ochratoksyny A w próbce, mg/kg;

M- masa próbki do analizy, g (25,0);

T- masa ochratoksyny A odpowiadająca objętości roztworu A wprowadzonego do chromatografu, ng;

V 1 - objętość roztworu do ekstrakcji, cm 3 (100);

D - bezwzględna granica błędu:

D - granica błędu względnego metody (wskaźnik dokładności), % (tab. 1).

Jeżeli zawartość ochratoksyny A w próbce jest mniejsza niż dolna granica zakresu oznaczanych stężeń, wynik analizy przedstawia się jako:

* 0,0001 mg/kg to granica wykrywalności.

8.3. Sprawdzenie akceptowalności wyników równoległych oznaczeń

Dopuszczalna rozbieżność między równoległymi pomiarami (R) wyznaczane są na podstawie granicy powtarzalności (R) (Tabela 1):

R = 0,01 (R, %) × , mg/kg

Jeżeli rozbieżność pomiędzy równoległymi definicjami nie przekracza dopuszczalnej granicy:

następnie jako wynik analizy przyjmuje się średnią arytmetyczną.

Jeśli norma zostanie przekroczonaRpomiary należy powtórzyć wykorzystując próbki rezerwowe.

. Kontrola jakości wyników pomiarów

Częstotliwość monitorowania błędów pomiarowych uzależniona jest od liczby pomiarów eksploatacyjnych w okresie kontrolowanym i ustalana jest w planach kontroli.

Próbkami kontrolnymi są próbki robocze surowców i produktów spożywczych. Weź próbkę i podziel ją na 2 równe części. Jeden z nich pozostawia się bez zmian, a do drugiego dodaje się taką ilość roztworu mianowanego ochratoksyny A, aby jej udział masowy w próbce wzrósł o 50 - 100% w stosunku do wartości początkowej. Dodatek należy wprowadzić do próbki przed rozpoczęciem przygotowania próbki.

Obie próbki poddaje się analizie ściśle według instrukcji metodologii i uzyskuje się wyniki analizy próbki pierwotnej ( C (zaprzeczenie A)) i próbki z dodatkiem ( Z ¢ (zaprzeczenie A)). Oznaczenie przeprowadza się w tych samych warunkach, a mianowicie: analizę prowadzi jeden analityk, stosując jeden zestaw naczyń miarowych, odczynników, roztworów itp.

Algorytm prowadzenia kontroli błędu operacyjnego metodą addytywną polega na porównaniu wyniku oznaczenia kontrolnego równego różnicy pomiędzy wynikiem pomiaru kontrolnego próbki z dodatkiem ( Z ¢ (ochra)), próbki bez dodatków ( C (strażnik A)) i ilość dodatku ( Z zew. (osłona A)) ze standardami kontroli operacyjnej (K). Decyzja o błędzie zadowalającym zostaje podjęta po spełnieniu warunku (jeżeli R i

Temperatura otoczenia od 15 do 25°C.

Wilgotność względna powietrza nie większa niż 80% przy 25°C.

Ciśnienie atmosferyczne 730 - 760 mm Hg.

Napięcie zasilania: 210 - 220 V. Częstotliwość prądu przemiennego: 45 - 50 Hz.