Okratoksinlər əmələ gətirən göbələklər Aspergillus və Penicillium cinsinin göbələkləridir. A. ochraceus göbələyinin tullantı məhsullarının ördəklərə toksikliyi haqqında ilk hesabatlar 1965-ci ildə Skott tərəfindən hazırlanmışdır. Sonrakı illərdə bu göbələyin tullantı məhsullarını təmiz formada, deşifrədən təcrid etmək üçün çoxlu sayda tədqiqatlar aparılmışdır. təcrid olunmuş mikotoksinlərin kimyəvi quruluşunu, onların bioloji aktivliyini, toksin əmələ gəlmə şərtlərini, müxtəlif bioloji substratlarda təyini üsullarını öyrənir. Oxratoksinlər bu mikotoksinin ilk istehsalçısı olan göbələk növünə görə adlandırılmışdır.

A. ochraceus göbələklərinin kulturasından dörd oxratoksin təcrid edilmişdir - A, B, C və D. Oxratoksin A ən böyük sanitar və toksikoloji əhəmiyyətə malikdir, asetonda, benzolda, asetonitrildə, xloroformda və spirtdə yaxşı həll olunur. Dəmir xloridlə qarşılıqlı əlaqədə olduqda qırmızı kompleks, qələvilərlə isə güclü komplekslər əmələ gətirir.

Okratoksinlər istehsal edən əsas göbələklər A. ochraceus və P. vedicatumdur. İsti iqlimi olan ölkələrdə yem ən çox A.ochraceus göbələyindən, mülayim iqlimli ölkələrdə - P.veridicatum göbələkindən oxratoksinlə çirklənir. Becərmə zamanı ən böyük toksin əmələ gəlməsinin baş verdiyi optimal substrat temperaturu A.ochraceus göbələkləri üçün 28 °C, P. vedicatum göbələkləri üçün 20 °C-dir.

N.V.Volkovun (1980) məlumatına görə, Ukraynada beş donuzçuluq kompleksində təcrid olunmuş 316 göbələk təcridindən 106 ştam (33,5%) A.ochraceus göbələkləri kimi təsnif edilmişdir. Bu miqdardan dörd izolat okratoksin A istehsal etdi.

Göbələklər - okratoksin A istehsalçıları - Rusiyada yemlərdə tez-tez rast gəlinir, lakin heyvan xəstəliyinin çox az halı qeydə alınıb. Bu, yemdə oxratoksin A-nın təyini üçün həssas və spesifik metodun olmaması ilə əlaqədardır. Bu yaxınlarda Kursk və Belqorod vilayətlərində bir sıra donuz təsərrüfatlarında okratoksikoz A aşkar edilmişdir (G. P. Kononenko et al., 1999).

Oxratoksinlər, digər mikotoksinlər kimi, heyvanların orqanizmində nisbətən tez məhv edilir. Bununla belə, dozadan asılı olaraq mikotoksinin donuzların əzələ toxumasında və əzələlərində 2 həftəyə qədər, qaraciyərdə 3 həftəyə qədər, böyrəklərdə isə 4 həftəyə qədər qala biləcəyi barədə məlumatlar var. Buna görə də, mikotoksinin orqanizmə daxil olmasının son halından sonra heyvanların kəsilməsi üçün son müddəti 4 həftə təyin etmək lazımdır. Nisbətən böyük miqdarda yem vasitəsilə qəbul edildikdə, mikotoksin süddə sərbəst buraxılması da mümkündür.

Oxratoksin A yüksək zəhərli birləşmələrə aiddir - laboratoriya heyvanları üçün LD5o birdəfəlik oral tətbiqi ilə heyvan çəkisi 20-28 mq/kq, 7 günlük toyuqlar üçün 11-15 mt/kq. Mikotoksin açıq-aşkar yığılma nümayiş etdirir. Donuzlar, xüsusən də cavanlar buna ən çox həssasdırlar, sonra quşlar.

Yemdə mikotoksin miqdarı 0,2-0,4 mq/kq yem olduqda, donuzlarda, hətta uzun müddət qidalandıqda belə, intoksikasiyanın klinik əlamətləri müşahidə olunmasa da, heyvan çəkisinin azalması və poliuriya müşahidə olunur. Toyuqlar üçün subtoksik doza 0,6-0,8 mq/kq yem, zəhərli doza 1,5-2,0 mq/kq təşkil edir. Yemdə oxratoksin A-nın miqdarı 5 mq/kq-a qədər artdıqda, donuzlarda və toyuqlarda ayrı-ayrı heyvanların zəhərlənmə və tələf olma əlamətləri aşkar edilmişdir.

Toksikodinamika. Kifayət qədər aydın deyil. Oxratoksin A ilk növbədə böyrəklərə təsir edir, buna görə də bu mikotoksikozun ilk dəfə donuzlarda qeydə alındığı Danimarkada bunu “donuz mikotoksik nefropatiyası” adlandırırdılar. Müəyyən edilmişdir ki, qana daxil olan okratoksinlər onun zülallarına nisbətən tez bağlanır. Ola bilsin ki, böyrəklərin turşu mühitinə daxil olan mikotoksin sərbəst buraxılır və nefropatik təsir göstərir.

Klinika. Praktik şəraitdə daha tez-tez baş verən xroniki okratoksikoz özünü çox zəif göstərir. Heyvanlarda susuzluq artır, poliuriya ifadə edilir, çəki artımı azalır. Bəzi hallarda qanda leykositoz, limfositlərin sayının artması və bazofillərin azalması qeyd olunur. Toyuqlarda ümumi depressiya, lələklərin fırlanması, məhsuldarlığın azalması müşahidə olunur. Bəzi müəlliflərin fikrincə, yumurtaların qabıqlarında sarı ləkələr görünür.

Müalicə. Xüsusi müalicə üsulları yoxdur. İlk növbədə, tərkibində okratoksin A olan və ya kiflə çirklənmiş yemlər pəhrizdən xaric edilməlidir. Yemlərə müxtəlif adsorbentlərin, məsələn, seolitlərin, qlaukonitlərin və s. daxil edilməsi effektivdir.

Patoloji dəyişikliklər. Okratoksikozun ən çox görülən simptomu böyrəklərin zədələnməsidir. Bir qayda olaraq, onlar böyüdülür, kapsul bəzi yerlərdə kortekslə bağlıdır. Bölmədə korteks solğundur; kapsulun altında 1 - 2 mm ölçüdə kistlər ola bilər. Histoloji müayinədə proksimal boru hüceyrələrinin nekrozu, kortikal təbəqədə birləşdirici toxumanın proliferasiyası aşkar edilir.

Bəzən qarın boşluğunda mayenin miqdarının artması müşahidə olunur. Bəzi hallarda qaraciyər böyüyür və onun hüceyrələri nekrotik olur.

Baytarlıq müayinəsi. Okratoksikoz zamanı heyvanların məcburi kəsimi zamanı orqan və toxumalarda, xüsusən də böyrəklərdə mikotoksinin olub-olmaması yoxlanılmalıdır. Ət və sakatatlarda oxratoksin üçün MRL müəyyən edilməmişdir. Mikotoksin qalıqları aşkar edilərsə, karkas və daxili orqanlar utilizasiya olunur.

Vərəqə

Dəstlər ferment immunoassay üçün test sistemləridir. Onlar lazımi reagentlərlə birlikdə İSO 9000 standartına uyğun olaraq kütləvi istehsal olunur və dənli bitkilərdə, yemdə, taxıl məhsullarında, pivədə və qan zərdabında oxratoksinin kəmiyyətcə təyini üçün nəzərdə tutulub. Test sistemlərindən istifadə qaydaları RIDASCREEN ® FAST Okratoksin A Və RIDASCREEN ® Okratoksin A nömrə altında Rusiya Kənd Təsərrüfatı Nazirliyinin Kənd Təsərrüfatı Federal Agentliyinin Baytarlıq İdarəsi tərəfindən təsdiq edilmişdir. MUK 5-1-14/1001. Sistemlər “Heyvanların, balıqların, arıların xəstəliklərinin diaqnostikası, habelə heyvan və bitki mənşəli xammalın təhlükəsizliyinin monitorinqi üçün dövlət baytarlıq laboratoriyalarında istifadə üçün təsdiq edilmiş normativ sənədlərin Siyahısı”na daxildir. Test sistemləri RIDASCREEN ® FAST Okratoksin A uyğun gəlir GOST 34108-2017"Yem, qarışıq yem, yem xammalı. Mikotoksin tərkibinin birbaşa bərk fazalı rəqabətli ferment immunoanalizi ilə təyini".

Taxıl, yem, taxıl məmulatları, pivə və qan serumunda oxratoksin A-nın təyini

Oxratoksin cinsin kif göbələklərinin fəaliyyəti nəticəsində əmələ gələn zəhərli maddədir Aspergillus Və Penicillium. Okratoksin ağır nefrotoksikliklə yanaşı hepatotoksiklik, teratogen, kanserogen və immunosupressiv xüsusiyyətlərə malikdir. Okratoksin insan orqanizminə bitki və heyvan mənşəli məhsullarla daxil ola bilər. O, təkcə taxıl bitkilərində (müsbət nümunələrin 13%-i) və heyvan yemində deyil, həmçinin donuz qanında (müsbət nümunələrin 60%-i) və böyrəklərdə (müsbət nümunələrin 21%-i) rast gəlinir.

Gömrük İttifaqının Texniki Qaydaları TR CU 021/2011 "Qida məhsullarının təhlükəsizliyi haqqında" okratoksin A tərkibinin aşağıdakı maksimum səviyyəsini tənzimləmək: qida taxıllarında, dənli bitkilərdə, unda - 0,005 mq/kq (5 μq/kq); uşaq qidasında, məktəbəqədər və məktəblilər üçün qida məhsullarında, hamilə və laktasiya edən qadınlar üçün qida məhsullarında - icazə verilmir (<0,0005 мг/кг).

Federal qanun layihəsi № 349084-5 “Şərab məhsulları üçün texniki reqlament” şərabda 0,002 mq/l-dən çox olmayan okratoksin A-nın tərkibinə dair tələbləri müəyyən edir.

"Yeyinti məhsullarının təhlükəsizliyinə və onların istehsalı, saxlanması, daşınması, satışı və utilizasiyası prosesləri ilə bağlı tələblər haqqında" Federal Qanunun layihəsində, tərkibində 0,005-dən çox olmayan okratoksin A üçün qida taxıllarına məcburi nəzarət tələbi də daxildir. mq/kq. Mövcud hüquqi tənzimləmələri veb saytında tapa bilərsiniz compact24.com.

Son vaxtlara qədər okratoksinin monitorinqi üçün əsasən xromatoqrafik üsullardan (yüksək performanslı maye xromatoqrafiyası, nazik təbəqənin xromatoqrafiyası) istifadə olunurdu. Daha rahat bir üsul, çox yüksək həssaslığa malik olan fermentlə əlaqəli immunosorbent analizidir (ELISA və ya ELISA).

Spesifikasiya:	RIDASCREEN ® FAST Okratoksin A	RIDASCREEN ® Okratoksin A 30/15
Format:	Zolaq lövhəsi, 48 quyu (8 quyudan 6 zolaq)	Zolaq lövhəsi, 96 quyu (8 quyudan 12 zolaq)
Standartlar:	0/5/10/20/40 µg/l	0 / 50 / 100 / 300 / 900 / 1800 ng/l
Nümunə hazırlığı:	Nümunələrin üyüdülməsi, çıxarılması, filtrasiyası	ekstraksiya, sentrifuqasiya/süzülmə (taxıl, yem); ekstraksiya, sentrifuqa, filtrasiya, silkələmə, həddindən artıq ekstraksiya, sentrifuqa, buxarlanma (pivə/qan serumu)
Vaxt xərcləri:
Aşkarlama limiti:	0,005 mq/kq	0,001250 mq/kq (taxıl, yem) 0,000050 mq/kq (pivə, qan serumu)

Əlaqədar Məhsullar:

Okratoksinlər bəzi növ göbələklər tərəfindən istehsal olunur Aspergillus Və Penicillium. Əsas istehsalçılardır A.ochraceus Və P. viridicatum. Bu göbələklərə hər yerdə rast gəlinir. Aspergillus yüksək temperaturda və rütubətdə okratoksinlər istehsal edir və Penicillium artıq 5ºС-də. Okratoksinlər aydın teratogen təsiri olan yüksək zəhərli birləşmələrdir.

A, B və C okratoksinləri izokumarinlər olan strukturca oxşar birləşmələr qrupudur. L- fenilalanin peptid bağı. Radikalların xarakterindən asılı olaraq müxtəlif növ okratoksinlər əmələ gəlir (cədvəl 2.3.).

Oxratoksin A rəngsiz kristal maddədir, suda az həll olunur, qütb üzvi həlledicilərdə (metanol, xloroform), həmçinin natrium karbonatın sulu məhlulunda orta dərəcədə həll olunur. Kimyəvi cəhətdən təmiz formada qeyri-sabitdir və işığa və havaya çox həssasdır, lakin etanol məhlulunda uzun müddət dəyişməz qala bilər. UV işığında yaşıl floresan var.

Oxratoksin B kristal maddədir, xlor atomu olmayan okratoksin A-nın analoqudur. O, okratoksin A-dan təxminən 50 dəfə az zəhərlidir. UV işığında mavi floresan edir.

Okratoksin C amorf maddədir, okratoksin A-nın etil esteridir, toksiklik baxımından ona yaxındır, lakin qida və yemin təbii çirkləndiricisi kimi aşkar edilməmişdir. U işığında solğun yaşıl flüoresansa malikdir.

Oxratoksinlər zəhərli mikotoksinlərə aiddir, qaraciyər, böyrəklər üçün yüksək toksiklik, teratogen və immunosupressiv xüsusiyyətlərə malikdir və açıq hemolitik təsir göstərir. Okratoksinlərdən ən zəhərlisi oxratoksin A-dır (LD 50 = 3,4 mq/kq, (bir günlük cücələr, ağızdan)). Aflatoksinlərdən daha zəhərlidir. Bu qrupdakı digər mikotoksinlər daha az toksikdir.

Okratoksinlərin biokimyəvi, molekulyar və hüceyrə təsir mexanizmləri kifayət qədər öyrənilməmişdir. Məlumdur ki, oxratoksin A zülal sintezinin ilkin mərhələsində əsas rol oynayan spesifik ferment olan fenilalaninin - t-RNT-nin fəaliyyətini maneə törətməklə zülal sintezini və karbohidrat mübadiləsini, xüsusən qlikonogenezi boğur.

Okratoksin A qarğıdalı, arpa, buğda, yulaf və arpada olur. Əhəmiyyətli və təhlükəli fakt ondan ibarətdir ki, yem taxılları və yem yüksək dərəcədə çirkləndikdə, heyvandarlıq məhsullarında (vetçina, donuz, kolbasa) oxratoksin A aşkar edilir. Okratoksin B nadirdir. Okratoksinlər bağçılıq bitkilərinin bütün meyvələrinə də təsir edir. Almalar xüsusilə ciddi şəkildə təsirlənir: məhsulun 50% -ə qədəri mikotoksinlərlə çirklənə bilər.

Qeyd etmək lazımdır ki, okratoksinlər sabit birləşmələrdir. Məsələn, okratoksin A ilə çirklənmiş buğdanın uzun müddət qızdırılması ilə onun tərkibi cəmi 32% azaldı (250-300ºС temperaturda). Belə ki, qida məhsullarında yayılması, oxratoksinlərin toksikliyi və davamlılığı insan sağlamlığı üçün real təhlükə yaradır.

Təhlil üsulları

Okratoksin A oksidləşmiş qidalarda olur. Ekstraksiya üçün istifadə olunan bir çox üzvi həlledicidə asanlıqla həll olunur. Ən çox istifadə edilən xloroform və fosfor turşusunun sulu məhlulu ilə ekstraksiya, sonra isə TLC metodundan istifadə edərək sütunun təmizlənməsi və kəmiyyətinin müəyyən edilməsidir.

HPLC metodu da işlənib hazırlanmışdır. HPLC analizindən əvvəl nümunə aşağıdakı kimi hazırlanır. Əzilmiş nümunə 2 M xlorid turşusu və 0,4 M maqnezium xlorid məhlulu qarışığı ilə müalicə olunur. Homojenləşdirildikdən sonra 60 dəqiqə toluol ilə çıxarın. Qarışıq sentrifuqalanır. Santrifüj silikagel sütunundan keçirilir və toluol və aseton qarışığı ilə yuyulur (mobil faza). Oxratoksin A toluol və sirkə turşusu (9:1) qarışığı ilə yuyulur və 40°C-də qurudulur. Qalıq həll edilir və süzülür. Təhlil HPLC istifadə edərək həyata keçirilir.

Bundan əlavə, krevetlər və bakteriyalar üzərində bir sıra bioanalizlər hazırlanmışdır, lakin əldə edilən nəticələr okratoksinlərin təyini üçün bu üsullardan istifadə etməyə imkan verməmişdir.



Nümunədə okratoksin A konsentrasiyası, mq/kq

Nisbi xəta hədləri (dəqiqlik göstəricisi) (±d), %, R = 0,95

Təkrarlanma standart sapması (s r), %

Təkrarlanma limiti ( r), %

Maddənin çıxarılmasının tamlığı, %

4.2. Köməkçi avadanlıq

AVU-6S və ya oxşar tipli nümunələri silkələmək üçün aparat
Fırlanan buxarlandırıcı IR-1M tələ və ya oxşar
50 ilə 350 °C aralığında temperaturun saxlanması xətası ±2,5 olan elektrik laboratoriya qurutma şkafı
Məişət soyuducusu
Elektrik laboratoriya dəyirmanı EM-3A və ya oxşar pH metr	TU 46-22-236-79
Qarışdıran çubuqlu MM 5 tipli maqnit qarışdırıcı	TU 25-11.834-80
NSh 29 ilə 250 sm3, KnKSh 250-29/32 tipli düz dibli konusvari kolbalar	GOST 10394-74
Tünd şüşədən hazırlanmış vintli şüşə butulkalar (rəzil), həcmi 7 sm3
Volumetrik kolbalar, tutumu 100, 500, 1000 sm3 tip 2-100-2,2-500-2
Laboratoriya huniləri
Armud formalı kolbalar NSh 14.5 ilə 10 sm3, tipli GrKSh-10-14/23	GOST 10394-72

4.3. Reagentlər və materiallar

. Ölçmələr aparmağa hazırlaşır

5.1. Okratoksin A-nın standart məhlullarının hazırlanması

Standart saxlama məhlulu hazırlamaq üçün (oxratoksin A konsentrasiyası 10 ng/mkl) 5 mq kristallik okratoksin A nümunəsi 500 sm3 ölçülü kolbaya, 50 sm3 toluol-sirkə turşusu qarışığına (98:2% həcmində) qoyulur. ) əlavə edilir, maddə tam həll olunana qədər yaxşıca qarışdırılır və eyni həlledici qarışığı işarəyə gətirilir. Saxlama məhlulunun dəqiq konsentrasiyasını təyin etmək üçün onun optik sıxlığı 333 nm (D333) dalğa uzunluğunda ölçülür. Məhlulun konsentrasiyası düsturla hesablanır:

0,005 konsentrasiyası olan okratoksin A-nın işçi məhlullarını hazırlamaq; 0,05 və 0,1 ng/μl, 50, 500 və 1000 μl konsentrasiyası 0,5 ng/μl olan məhlul götürün, quruyana qədər buxarlayın və mobil fazanın 5 sm3-də həll edin.

Okratoksin A saxlama məhlulu bir ilə qədər qaranlıq, sərin yerdə (təxminən 0 °C temperaturda) üyüdülmüş tıxaclı şüşə qabda saxlanılır və işlək standart məhlulların hazırlanması üçün istifadə olunur. İşləyən standart məhlullar qaranlıq şüşə flakonlarda sərin, qaranlıq yerdə (təxminən 0 °C temperaturda) 1 ay saxlanılır.

İşləyən standart məhlullardan istifadə etməzdən əvvəl onlar otaq temperaturuna gətirilməlidir və yalnız bundan sonra qapaqlar açılmalıdır.

5.2. Fosfat tampon məhlulunun hazırlanması, pH = 7,4

1,15 q ağırlığında natrium fosfat disəbədsiz 12 su nümunəsi, 0,124 q ağırlığında natrium monoəvəzedici 2 su nümunəsi və 1,74 q ağırlığında natrium xlorid nümunəsi 1010 sm3 tutumlu bir ölçmə kolbasına köçürülür, əlavə olunur - 20 sm3 distillə edilmiş su. Qarışdırın və kolbadakı məhlulun həcmini işarəyə uyğunlaşdırın. Raf ömrü: Soyuducuda 1 ay.

5.3. Həlledici qarışıqların hazırlanması

Toluol-sirkə turşu (98:2 % haqqında.).

1000 sm3 ölçülü kolbaya 20 sm3 sirkə turşusu əlavə edin və qarışdıraraq toluolla işarəyə uyğunlaşdırın. Yararlılıq müddəti: 1 ay sərin, qaranlıq yerdə.

Asetonitril-su (60:40 % haqqında.).

1000 sm3 ölçülü kolbaya 600 sm3 asetonitril əlavə edin və qarışdırarkən işarəyə su əlavə edin. Yararlılıq müddəti: 1 ay sərin, qaranlıq yerdə.

Asetonitril-su (60:40 % haqqında.; pH = 3 ,0 ).

1000 sm3 ölçülü kolbaya 600 sm3 asetonitril əlavə edin və qarışdıraraq ikiqat distillə edilmiş su ilə işarəyə çatdırın. Fosfor turşusu əlavə edilərək, qarışığın pH-ı 3,0 dəyərinə uyğunlaşdırılır. Yararlılıq müddəti: 1 ay sərin, qaranlıq yerdə.

Metanol-sirkə turşu (98:2 % haqqında.).

1000 sm3 ölçülü kolbaya 20 sm3 sirkə turşusu əlavə edin və qarışdıraraq metanolla işarəyə çatdırın. Yararlılıq müddəti: 1 ay sərin, qaranlıq yerdə.

. Analiz üçün nümunələrin seçilməsi və hazırlanması

6.1. Nümunə götürmə

Müəyyən növ məhsulların nümunələrinin götürülməsinin xüsusiyyətlərini nəzərə almaq üçün mövcud normativ və texniki sənədləri rəhbər tutmaq lazımdır:

"Qarğıdalı. Qəbul qaydaları və nümunə götürmə üsulları” QOST 13586.3-83;

“Yarma. Qəbul qaydaları və nümunə götürmə üsulları” QOST 26312.1-84;

“Un və kəpək. Qəbul və nümunə götürmə üsulları" QOST 27668-88;

“Konservləşdirilmiş qida məhsulları. Nümunələrin götürülməsi və sınaq üçün hazırlanması" GOST 8756.0-70.

Bütün lot üçün mikotoksin konsentrasiyasını təmsil edən analiz üçün nümunələr 2 kq ağırlığında əvvəlcədən homogenləşdirilmiş orta (ilkin) nümunədən götürülməlidir.

6.2. Analiz üçün nümunələrin hazırlanması

Seçilmiş nümunələr laboratoriya dəyirmanında 1-2 dəqiqə əzilir. Bu vəziyyətdə iki paralel nümunə istifadə olunur.

6.2.1. Çıxarma

25 q xırdalanmış nümunə nümunəsi 250 sm düz dibli konusvari kolbaya qoyulur və 100 sm3 asetonitril-su qarışığı (60:40% həcm) əlavə edilir. Nümunə çalkalayıcıdan istifadə edərək 30 dəqiqə çıxarın. Nəticədə qarışıq mavi lent qatlanmış kağız filtrindən süzülür. 10 sm3 filtrat götürün və 90 sm fosfat tampon məhlulu əlavə edin, pH = 7,4.

6.2.2. Təmizləmə ekstraktı

Nəticədə qarışıqdan 100 ml saniyədə 1 - 2 damcı sürəti ilə immunoaffinity sütununa tətbiq edilir, 20 sm3 fosfat tampon məhlulu ilə yuyulur, pH = 7.4. Oxratoksin A 3 sm3 metanol-sirkə turşusu qarışığı (98: 2% həcm) ilə yuyulur.

. Ölçmələrin aparılması

7.1. Test nümunəsinin hazırlanması

Eluat quruyana qədər buxarlanır. Quru qalıq 400 μl mobil fazada həll olunur (A məhlulu).

7.2. Xromatoqrafiya şərtləri

HPLC şərtləri: mobil faza - asetonitril-su (60:40% həcm; pH = 3,0); mobil faza sürəti - 1,5 sm3 / dəq.

Flüorimetrik detektor 333 nm həyəcan verici radiasiya dalğasına quraşdırılıb və emissiya xəttində 466 nm keçid diapazonlu emissiya filtri quraşdırılıb.

Nümunələri təhlil etmək üçün 50 μl test nümunəsi (məhlul A) mikroşprisdən istifadə edərək xromatoqraf injektoruna yeridilir. Okratoksin A ilə tutma müddətində üst-üstə düşən pik varsa, inyeksiyada oxratoksin A-nın kütləsi kalibrləmə qrafikindən istifadə etməklə hesablanır.

. Ölçmə nəticələrinin işlənməsi

8.1. Dərəcəli bir əlaqənin qurulması

Kalibrləmə əyrisini qurmaq üçün standartların bir sıra işçi həllərinin xromatoqrafik təhlili aparılır. 0,005 ng/μl konsentrasiyası olan 50 μl işləyən standart məhlul mikroşprisdən istifadə edərək injektora yeridilir ki, bu da 0,25 ng okratoksin A-ya uyğundur. Eyni şey 0,05 və 0,10 ng/mkl konsentrasiyası olan digər standart məhlullar üçün də edilir. , bu da öz növbəsində inyeksiyada 2,5 və 5,0 ng okratoksin A-ya uyğundur. Bu şərtlərdə okratoksin A-nın saxlanma müddəti 4 ilə 5 dəqiqə arasındadır. Alınan məlumatlara əsasən, kalibrləmə qrafiki qurulur (xromatoqrafik pik sahəsinin enjeksiyondakı okratoksin A kütləsindən asılılığı).

Təhlilin nəticəsi formada təqdim olunur (ehtimalla R = 0,95):

D - mütləq səhv həddi:

d - texnikanın nisbi xətasının həddi (dəqiqlik göstəricisi), % (cədvəl 1).

* 0,0001 mq/kq aşkarlama həddidir.

. İfaçının ixtisas tələbləri

Taxıl və taxıl məhsullarında oxratoksin A-nın analizinin aparılmasına xüsusi ali və ya orta ixtisas təhsilli, HPLC analizi texnikasını mükəmməl bilən, müvafiq hazırlıq keçmiş və kimyəvi laboratoriyada iş təcrübəsi olan şəxslərə icazə verilir.

. Ölçmə şərtləri

Ətraf mühitin temperaturu 15 ilə 25 °C arasında.

25 ° C-də nisbi hava rütubəti 80% -dən çox deyil.

Atmosfer təzyiqi 730 - 760 mm Hg.

Enerji təchizatı gərginliyi: 210 - 220 V. AC tezliyi: 45 - 50 Hz.

Nümunədə okratoksin A konsentrasiyası, mq/kq

Nisbi səhv hədləri (dəqiqlik göstəricisi) (±d), %, R = 0,95

Təkrarlanan standart sapma (s r), %

Təkrarlanma limiti ( r), %

Maddənin çıxarılmasının tamlığı, %

4. Ölçmə vasitələri, köməkçi cihazlar, şüşə qablar, reagentlər və materiallar

4.1. Ölçmə vasitələri

4.2. Köməkçi avadanlıq

AVU-6S və ya oxşar tipli nümunələri silkələmək üçün aparat	TU 64-1-2451
Fırlanan buxarlandırıcı IR-1M tələ və ya oxşar	TU 25-11917
50 ilə 350 °C arasında temperaturun saxlanması xətası ±2,5 olan elektrik laboratoriya qurutma şkafı	TU 16-531.639
Məişət soyuducusu
Elektrik laboratoriya dəyirmanı EM-3A və ya oxşar pH metr	TU 46-22-236-79
Qarışdıran çubuqlu MM 5 tipli maqnit qarışdırıcı	TU 25-11.834-80
NSh 29, KnKSh 250-29/32 tipli düz dibli konusvari kolbalar 250 sm 3	GOST 10394-74
Tünd şüşədən hazırlanmış vintli şüşə butulkalar (rəzil), həcmi 7 sm 3
Volumetrik kolbalar, tutumu 100, 500, 1000 sm 3 tip 2-100-2,2-500-2
Laboratoriya huniləri
Armud formalı kolbalar 10 sm 3 NSh 14.5 ilə, tipli GrKSh-10-14/23	GOST 10394-72

4.3. Reagentlər və materiallar

Natrium fosfat, monoəvəz edilmiş, 2-su, analitik dərəcəli
Natrium xlorid, reagent dərəcəsi
Asetonitril, xüsusi təmizlik dərəcəsi, 0 dərəcəli
Metanol, xüsusi təmizlik
Fosfor turşusu, xüsusi təmizlik	TU 2612-014-00203677-97
Buzlu sirkə turşusu, reagent dərəcəsi
Toluol, analitik dərəcəli
İmmunoaffinlik sütunları Ochraprep (R-Biopharm, Böyük Britaniya)

. Ölçmələr aparmağa hazırlaşır

5.1. Okratoksin A-nın standart məhlullarının hazırlanması

Standart saxlama məhlulu (oxratoksin A konsentrasiyası - 10 ng/mkl) hazırlamaq üçün 5 mq kristallik okratoksin A nümunəsi 500 sm 3 ölçülü kolbaya, 50 sm 3 toluol-sirkə turşusu qarışığına (98:2%) qoyulur. c.) əlavə edilir, maddə tamamilə həll olunana qədər diqqətlə qarışdırın və eyni həlledicilərin qarışığı ilə işarəyə qədər seyreltin. Saxlama məhlulunun dəqiq konsentrasiyasını təyin etmək üçün onun optik sıxlığı 333 nm (D 333) dalğa uzunluğunda ölçülür. Məhlulun konsentrasiyası düsturla hesablanır:

Sonra, konsentrasiyası 10 ng/μl olan oxratoksin A-nın 5 sm 3 standart məhlulu toluol-sirkə turşusu (98: 2% həcm) qarışığı ilə 100 sm 3 həcmə qədər seyreltilir və işçi məhlul alınır. 0,5 ng/μl konsentrasiyası ilə.

0,005 konsentrasiyası olan okratoksin A-nın işçi məhlullarını hazırlamaq; 0,05 və 0,1 ng/μl, 50, 500 və 1000 μl konsentrasiyası 0,5 ng/μl olan məhlul götürün, quruyana qədər buxarlayın və mobil fazanın 5 sm 3-də həll edin.

Okratoksin A saxlama məhlulu bir ilə qədər qaranlıq, sərin yerdə (təxminən 0 °C temperaturda) üyüdülmüş tıxaclı şüşə qabda saxlanılır və işlək standart məhlulların hazırlanması üçün istifadə olunur. İşləyən standart məhlullar qaranlıq şüşə flakonlarda sərin, qaranlıq yerdə (təxminən 0 °C temperaturda) 1 ay saxlanılır.

İşləyən standart məhlullardan istifadə etməzdən əvvəl onlar otaq temperaturuna gətirilməlidir və yalnız bundan sonra qapaqlar açılmalıdır.

5.2. Fosfat tampon məhlulunun hazırlanması, pH = 7,4

1,15 q ağırlığında natrium fosfat disəbədsiz 12 su nümunəsi, 0,124 q ağırlığında natrium monoəvəzedici 2 su nümunəsi və 1,74 q ağırlığında natrium xlorid nümunəsi 100 sm 03 tutumlu bir ölçmə kolbasına köçürülür, - əlavə edin. 20 sm 3 distillə edilmiş su. Qarışdırın və kolbadakı məhlulun həcmini işarəyə uyğunlaşdırın. Raf ömrü: Soyuducuda 1 ay.

5.3. Həlledici qarışıqların hazırlanması

Toluol-sirkə turşu (98:2 % haqqında.).

1000 sm 3 ölçülü kolbaya 20 sm 3 sirkə turşusu əlavə edin və qarışdıraraq, toluolla işarəyə uyğunlaşdırın. Yararlılıq müddəti: 1 ay sərin, qaranlıq yerdə.

Asetonitril-su (60:40 % haqqında.).

1000 sm 3 ölçülü kolbaya 600 sm 3 asetonitril əlavə edin və qarışdıraraq su ilə işarəyə gətirin. Yararlılıq müddəti: 1 ay sərin, qaranlıq yerdə.

Asetonitril-su (60:40 % haqqında.; pH = 3 ,0 ).

1000 sm 3 ölçülü kolbaya 600 sm 3 asetonitril əlavə edin və qarışdıraraq ikiqat distillə edilmiş su ilə işarəyə gətirin. Fosfor turşusu əlavə edilərək, qarışığın pH-ı 3,0 dəyərinə uyğunlaşdırılır. Yararlılıq müddəti: 1 ay sərin, qaranlıq yerdə.

Metanol-sirkə turşu (98:2 % haqqında.).

1000 sm 3 ölçülü kolbaya 20 sm 3 sirkə turşusu əlavə edin və qarışdıraraq metanol ilə işarəyə gətirin. Yararlılıq müddəti: 1 ay sərin, qaranlıq yerdə.

. Analiz üçün nümunələrin seçilməsi və hazırlanması

6.1. Nümunə götürmə

Müəyyən növ məhsulların nümunələrinin götürülməsinin xüsusiyyətlərini nəzərə almaq üçün mövcud normativ və texniki sənədləri rəhbər tutmaq lazımdır:

"Qarğıdalı. Qəbul qaydaları və nümunə götürmə üsulları” QOST 13586.3-83;

“Yarma. Qəbul qaydaları və nümunə götürmə üsulları” QOST 26312.1-84;

“Un və kəpək. Qəbul və nümunə götürmə üsulları" QOST 27668-88;

“Konservləşdirilmiş qida məhsulları. Nümunələrin götürülməsi və sınaq üçün hazırlanması" GOST 8756.0-70.

Bütün lot üçün mikotoksin konsentrasiyasını təmsil edən analiz üçün nümunələr 2 kq ağırlığında əvvəlcədən homogenləşdirilmiş orta (ilkin) nümunədən götürülməlidir.

6.2. Analiz üçün nümunələrin hazırlanması

Seçilmiş nümunələr laboratoriya dəyirmanında 1-2 dəqiqə əzilir. Bu vəziyyətdə iki paralel nümunə istifadə olunur.

6.2.1. Çıxarma

25 q xırdalanmış nümunə nümunəsi 250 sm düz dibli konusvari kolbaya qoyulur və 100 sm 3 asetonitril-su qarışığı (60:40% həcm) əlavə edilir. Nümunə çalkalayıcıdan istifadə edərək 30 dəqiqə çıxarın. Nəticədə qarışıq mavi lent qatlanmış kağız filtrindən süzülür. 10 sm 3 filtrat götürülür və 90 sm fosfat tampon məhlulu, pH = 7,4 əlavə edilir.

6.2.2. Təmizləmə ekstraktı

Nəticədə qarışıqdan 100 ml immunoaffinity sütununa saniyədə 1 - 2 damcı sürətlə tətbiq olunur, 20 sm 3 fosfat tampon məhlulu ilə yuyulur, pH = 7.4. Okratoksin A 3 sm 3 metanol-sirkə turşusu (98: 2% həcm) qarışığı ilə yuyulur.

. Ölçmələrin aparılması

7.1. Test nümunəsinin hazırlanması

Eluat quruyana qədər buxarlanır. Quru qalıq 400 μl mobil fazada həll olunur (A məhlulu).

7.2. Xromatoqrafiya şərtləri

HPLC şərtləri: mobil faza - asetonitril-su (60:40% həcm; pH = 3,0); mobil faza sürəti - 1,5 sm 3 / dəq.

Flüorimetrik detektor 333 nm həyəcan verici radiasiya dalğasına quraşdırılıb və emissiya xəttində 466 nm keçid diapazonlu emissiya filtri quraşdırılıb.

Nümunələri təhlil etmək üçün 50 μl test nümunəsi (məhlul A) mikroşprisdən istifadə edərək xromatoqraf injektoruna yeridilir. Okratoksin A ilə tutma müddətində üst-üstə düşən pik varsa, inyeksiyada oxratoksin A-nın kütləsi kalibrləmə qrafikindən istifadə etməklə hesablanır.

. Ölçmə nəticələrinin işlənməsi

8.1. Dərəcəli bir əlaqənin qurulması

Kalibrləmə əyrisini qurmaq üçün standartların bir sıra işçi həllərinin xromatoqrafik təhlili aparılır. 0,005 ng/μl konsentrasiyası olan 50 μl işləyən standart məhlul mikroşprisdən istifadə edərək injektora yeridilir ki, bu da 0,25 ng okratoksin A-ya uyğundur. Eyni şey 0,05 və 0,10 ng/mkl konsentrasiyası olan digər standart məhlullar üçün də edilir. , bu da öz növbəsində inyeksiyada 2,5 və 5,0 ng okratoksin A-ya uyğundur. Bu şərtlərdə okratoksin A-nın saxlanma müddəti 4 ilə 5 dəqiqə arasındadır. Alınan məlumatlara əsasən, kalibrləmə qrafiki qurulur (xromatoqrafik pik sahəsinin enjeksiyondakı okratoksin A kütləsindən asılılığı).

8.2. Nəticələrin qeydiyyatı

Nümunədə okratoksin A konsentrasiyası düsturla hesablanır:

C (mühafizə A)- nümunədə oxratoksin A-nın konsentrasiyası, mq/kq;

M- analiz üçün nümunənin kütləsi, g (25,0);

T- xromatoqrafa daxil edilmiş A məhlulunun həcminə uyğun gələn oxratoksin A kütləsi, ng;

V 1 - ekstraksiya üçün məhlulun həcmi, sm 3 (100);

D - mütləq səhv həddi:

d - metodun nisbi xətasının həddi (dəqiqlik göstəricisi), % (cədvəl 1).

Nümunədə okratoksin A-nın tərkibi müəyyən edilmiş konsentrasiyalar diapazonunun aşağı həddindən azdırsa, analizin nəticəsi aşağıdakı kimi təqdim olunur:

* 0,0001 mq/kq aşkarlama həddidir.

8.3. Paralel təyinatların nəticələrinin məqbulluğunun yoxlanılması

Paralel ölçmələr arasında icazə verilən uyğunsuzluq (R) təkrarlanma həddi əsasında müəyyən edilir (r) (Cədvəl 1):

R = 0,01 (r, %) × , mq/kq

Paralel təriflər arasındakı uyğunsuzluq icazə verilən həddi keçmirsə:

sonra analiz nəticəsində arifmetik orta alınır.

Standart aşılırsaRehtiyat nümunələrdən istifadə etməklə ölçmələr təkrarlanmalıdır.

. Ölçmə nəticələrinin keyfiyyətinə nəzarət

Ölçmə xətalarının monitorinqinin tezliyi nəzarət edilən dövr ərzində əməliyyat ölçmələrinin sayından asılıdır və nəzarət planları ilə müəyyən edilir.

Nəzarət nümunələri qida xammalı və qida məhsullarının işçi nümunələridir. Bir nümunə götürün və 2 bərabər hissəyə bölün. Onlardan biri dəyişməz qalır, digərinə isə elə miqdarda okratoksin A standart məhlul əlavə edilir ki, onun nümunədəki kütlə payı ilkin qiymətlə müqayisədə 50 - 100% artır. Aşqar nümunənin hazırlanmasına başlamazdan əvvəl nümunəyə daxil edilməlidir.

Hər iki nümunə metodologiya təlimatlarına ciddi uyğun olaraq təhlil edilir və orijinal nümunənin təhlilinin nəticələri alınır ( C (mənfi A)) və əlavə ilə nümunələr ( İLƏ ¢ (mənfi. A)). Müəyyənləşdirmə eyni şərtlərdə aparılır, yəni: analiz bir analitik tərəfindən bir həcmli şüşə qablar, reagentlər, məhlullar və s.

Aşqar metodundan istifadə edərək əməliyyat xətasına nəzarətin aparılması alqoritmi bir nümunənin nəzarət ölçülməsinin nəticəsi arasındakı fərqə bərabər olan nəzarət təyininin nəticəsini əlavə ilə müqayisə etməkdən ibarətdir ( İLƏ ¢ (oxra)), əlavəsiz nümunələr ( C (mühafizə A)) və əlavənin miqdarı ( Əlavə ilə (mühafizə A)) əməliyyat nəzarət standartları ilə (K). Qənaətbəxş xəta haqqında qərar aşağıdakı şərt yerinə yetirildikdə qəbul edilir (əgər R və

Ətraf mühitin temperaturu 15 ilə 25 °C arasında.

25 ° C-də nisbi hava rütubəti 80% -dən çox deyil.

Atmosfer təzyiqi 730 - 760 mm Hg.

Enerji təchizatı gərginliyi: 210 - 220 V. AC tezliyi: 45 - 50 Hz.